三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验,差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右,证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现,在随机挑取的阳性克隆中,95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段,这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列,分别属于8 大类,共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个,GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明,构建的差异表达cDNA文库,可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。     

基于rDNA ITS序列研究蚌科6种类的系统发生关系

通过测定核糖体转录间隔区ITS1以及ITS2序列研究了江苏地区蚌科(Unionidae)6种常见贝类——褶纹冠蚌(Cristaria plicata)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)、背角无齿蚌(Anodneta woodiana woodiana)、扭蚌(Arconaialanceolata)、圆顶珠蚌(Unio douglasiae)以及背瘤丽蚌(Lamprotula leai)的系统发生关系。结果显示:6种蚌的ITS1序列长度介于354~439 bp之间,平均G+C百分含量为52.7%;ITS2序列长度介于287~354 bp之间,平均G+C百分含量为51.2%。对6种贝类的相关序列进行比对,ITS1的比对长度包括501个位点,其中有364个变异位点和99个简约信息位点;ITS2的比对长度包括381个位点,其中有259个变异位点和66个简约信息位点。以虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)为外群,采用邻接法(NJ)分析6种贝类的系统发生关系,贝类明显聚合为3个类群:类群Ⅰ包括三角帆蚌(H.culingii)和背瘤丽蚌(L.leai),类群Ⅱ包括扭蚌(A.lanceolata)和圆顶珠蚌(U.douglasiae),类群Ⅲ由背角无齿蚌(A.woodiana woodiana)和褶纹冠蚌(C.plicata)组成。     

三角帆蚌内脏团培育圆形有核珍珠的试验

报导了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)内脏团培育圆形有核珍珠的试验结果。结果显示:插植珠核的7362只手术蚌植核后一个月内成活率99.2%。经23个月养殖后,随机抽取50只。结果留核率达94%,成珠率为86%,其中中高档珠占37.2%。有核珍珠直径在9.4~11.6 mm之间,其中10 mm以上占88.4%。11.6%的珍珠表面有小于3 mm的凸起,未发现带扁而长尾巴的珍珠。试验表明:三角帆蚌内脏团内能培育出高品质的有核珍珠。此外还发现,脱核或核片分离的细胞小片仍可在内脏团内形成珍珠。     

三角帆蚌钩介幼虫寄生胁迫对黄颡鱼营养指标的影响

为探索三角帆蚌Hyriopsis cumingii钩介幼虫寄生对寄主鱼营养指标的影响,测定了三角帆蚌钩介幼虫寄生胁迫对不同寄生阶段黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco血浆、肝脏和肌肉组织中糖原、游离脂肪酸、总蛋白、游离氨基酸含量的变化情况。结果表明:在相同时间点,寄生组与对照组鱼肝脏和肌肉中糖原含量均无显著性差异(P0.05);寄生组鱼肝脏中游离脂肪酸含量在寄生后期(12 d)显著低于对照组(P0.05),在寄生前期(2 d)、中期(5 d)与对照组无显著性差异(P0.05),寄生组鱼血浆、肌肉游离脂肪酸含量与对照组无显著性差异(P0.05);寄生组、对照组鱼在寄生中期和后期肝脏总蛋白含量均显著降低(P0.05),血浆、肌肉总蛋白含量无显著性变化(P0.05);寄生组鱼血浆游离氨基酸含量在寄生中期和后期显著低于对照组(P0.05),寄生组鱼肝脏游离氨基酸在寄生后期显著低于对照组(P0.05),寄生前期、中期与对照组无显著性差异(P0.05)。研究表明,钩介幼虫寄生会导致肝脏游离脂肪酸降低,血浆及肝脏游离氨基酸含量下降,推测脂肪酸和游离氨基酸可能是钩介幼虫变态发育的关键营养因子。     

池蝶蚌组织蛋白酶L1-like基因的克隆及表达特征分析

为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长c DNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的c DNA全长,命名为Hs Cts L1-like基因(Gen Bank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5′-非翻译区(5′UTR)为31 bp,3′-非翻译区(3′UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,Hs Cts L1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的Cts L签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在Hs Cts L1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏Cts L1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌Cts L(ADV03094)和池蝶蚌中另一个Cts L(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,Hs Cts L1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的Cts L1聚为一分支,推测Hs Cts L1-like属于Cts L家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测显示,Hs Cts L1-like m RNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏Hs Cts L1-like m RNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。     

缺氧和有毒微囊藻胁迫下三角帆蚌鳃和主要消化器官以及晶杆体的扫描电镜观察

为了阐明缺氧和有毒铜绿做囊藻对三角帆蚌鳃和主要消化器官的毒理效应和组织病理,实验利用扫描电镜研究了暴露于缺氧和有毒铜绿做囊藻下三角帆蚌的鳃、胃、肠以及晶杆体等器官组织病理学变化。结果显示,从第7天开始缺氧和有毒藻类复合胁迫组三角帆蚌的鳃丝及柱状细胞出现大量坏死和脱落,胃肠腔面纤毛脱落、上史细胞破裂坏死,晶杆体在第5天已经完全消失;第7天单独缺氧组和单独有毒藻类组的鳃和消化道出现少量的病变,单独缺氧组晶杆体在第7天完全消失,单独有毒藻类组晶杆体则一直存在。胁迫消失后,3个实验暴露组的晶杆体都未恢复正常对照组水平,因此缺氧和有毒铜绿做囊藻对三角帆蚌鳃和消化系统产生不可恢复性损伤,双重胁迫组影响最为严重,缺氧胁迫组相对有毒铜绿做囊藻胁迫组影响更为显著。本研究为三角帆蚌在缺氧和有毒藻类胁迫下的生理适应机制提供了组织病理学上的参考,并为其作为富营养化水体治理工具种的可行性提供了理论依据。     

两个三角帆蚌选育品系珍珠层颜色与外壳色L*a*b*值及其相关性分析

运用色差仪获得了两个三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)选育品系珍珠层颜色与外壳色的颜色参数L、a和b值,对各颜色参数进行了相关分析和回归分析,探索珍珠层颜色与外壳色之间的相关性。结果显示"紫皇后"珍珠层颜色与外壳后部颜色具有相关性,它们的L、a和b值均显著相关,相关系数分别为-0.456、0.371和-0.426,建立了"紫皇后"珍珠层对外壳后部各颜色参数的回归方程为L:y=80.49-0.53x(R~2=0.208),a:y=3.60+0.21x(R~2=0.137),b:y=4.69-0.35x(R~2=0.181);"白贵妃"珍珠层颜色与外壳后部颜色的L、a和b值显著或极显著相关,相关系数分别为-0.444、0.477和-0.390,表明"白贵妃"珍珠层颜色与外壳后部颜色显著相关,建立珍珠层对外壳后部各颜色参数的回归方程分别为L:y=87.36-0.21x(R~2=0.197),a:y=-1.77+0.23x(R~2=0.228),b:y=2.10-0.22x(R~2=0.152)。通过逐步判别分析获得了外壳色的2个参数(b和a),并构建了区分2个选育品系的判别函数:"紫皇后"的判别公式为YQ=1.786X1-0.384X2-4.440,"白贵妃"的判别公式为YW=0.321 X1+0.600 X2-4.763,综合判别率达90.0%。显示2个选育品系的外壳色差异非常明显,可通过判别分析进行可靠的区分。结果表明,对三角帆蚌外壳色的量化分析,可以对内部的珍珠层颜色进行可靠区分并进行量化推断。     

镉对背角无齿蚌外套膜细胞凋亡相关酶活性和细胞结构的影响

应用酶学和组织显微技术,研究了镉(Cd)对背角无齿蚌(Anodonta woodiana)外套膜组织中细胞凋亡相关酶Caspase-3,8,9活性、H2O2含量和组织细胞超微结构的影响。结果显示,与对照组相比,随着Cd质量浓度的增加,外套膜Caspase-3活性表现为先降低后显著升高的趋势(P0.05);Caspase-8活性呈现逐渐升高,差异显著(P0.05);Caspase-9活性在低质量浓度和高质量浓度组显著降低,但中高质量浓度组显著升高(P0.05)。随着Cd质量浓度的增加,外套膜中H2O2含量呈现逐渐增高的趋势,差异显著(P0.05)。当Cd质量浓度为16.86 mg/L时,外套膜组织细胞结构的变化明显;细胞核染色质不规则凝聚、固缩和边集,核膜破裂;线粒体肿胀、嵴数量减少、空泡化比较严重;微绒毛排列杂乱、大部分断裂并且空泡化严重。当Cd质量浓度为67.45 mg/L时,外套膜组织细胞损伤更加明显;染色质大部分凝聚、固缩和边集,核膜严重肿胀并破裂;粗面内质网板层状结构解体后形成许多大小不同的小泡。研究表明,外套膜在酶活性和组织细胞结构上对镉的反应较快且更具规律性,而且具有明显的剂量效应关系。     

镉对背角无齿蚌消化腺和鳃组织SOD活力的影响

研究镉对背角无齿蚌(Anodonta woodiana)消化腺和鳃超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响,探究各组织SOD活力对镉的响应机制。试验设1个对照组和3个镉(Cd~(2+),0.5,5.0,50.0 mg/L)暴露组。镉胁迫14 d后检测背角无齿蚌消化腺和鳃SOD活力;剩余的背角无齿蚌移入清水中饲养1 d后检测SOD活力。结果显示,14 d镉胁迫可显著抑制消化腺SOD活力,鳃SOD活力只在50 mg/L Cd~(2+)组被显著诱导;清水饲养1 d后,0.5 mg/L Cd~(2+)组消化腺SOD活力较胁迫14 d时有明显回升,但仍显著低于对照组,5,50 mg/L Cd~(2+)组消化腺SOD活力显著低于对照组,50 mg/L Cd~(2+)组鳃SOD活力回落至对照组水平。镉胁迫对背角无齿蚌消化腺和鳃SOD活力影响显著,消化腺反应更灵敏;清水处理对镉引起的SOD活力变化有一定的恢复作用。     

基于16SrDNA比较研究混养三角帆蚌和鲢鳙对池塘养殖水体微生物群落结构的影响

为了研究混养三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和鲢(Hypophthalmichthys molitrix)鳙(Aristichthys nobilis)对池塘养殖水体微生物群落结构的影响,分别在浙江海盐、江西九江、上海浦东开展了罗氏沼虾-三角帆蚌混养、草鱼—三角帆蚌混养、罗氏沼虾-三角帆蚌-鲢鳙鱼混养三组系列实验。利用DGGE技术对养殖水体的16S r DNA进行指纹图谱分析。三组实验共鉴定出57条不同条带,每组实验中混养三角帆蚌或鲢鳙实验组的平均条带数均高于单养水体水样平均条带数。Shannon多样性指数分析结果显示,各养殖水体混养三角帆蚌、鲢鳙后,多样性指数均有所增加。PCA分析和DGGE聚类结果显示,在无鲢鳙的情况下,蚌与主养物种(罗氏沼虾、草鱼)混养实验组的16S r DNA图谱聚为一类,显示出蚌对于微生物群落结构影响的贡献;在同时引入鲢鳙和蚌的情况下,16S r DNA指纹图谱则是按照有无鲢鳙聚为两类,提示在本实验中鲢鳙对于水体微生物的影响要大于蚌。对DGGE图谱其中20条显著条带进行回收、测序和系统发育分析,结果表明,所获序列主要分属于放线菌门(Actinobacteria,25%)、蓝藻门(Cyanobacteria,25%)、α-变形菌亚门(Alphaproteobacteria,15%)、β-变形菌亚门(Betaproteobacteria,15%)、γ-变形菌亚门(Gammaproteobacteria,10%)、ε-变形菌亚门(Epsilonproteobacteria,5%)、裸藻叶绿体(Euglenales,5%)。