密码子优化的甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗在小鼠体内免疫保护效力研究

为了提高甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗的免疫原性,本研究将流感病毒rPan09(HA和NA来自A/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因通过人工合成的方法将其密码子优化为哺乳动物体内偏嗜性密码子opti-HA,同未优化的rPan09的HA基因分别与真核表达载体pCAGGS连接构成重组质粒pCA-optiHA和pCA-HA转染293T细胞,48 h后采用间接免疫荧光的方法检测HA基因的体外表达情况,结果显示重组质粒pCA-optiHA的蛋白表达量明显高于pCA-HA。为评价这两种重组质粒的免疫及保护效力,选取6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将质粒pCA-HA、pCA-optiHA以100μg/只的剂量,进行后腿肌肉多点注射,同时设立空载体pCAGGS对照,共免疫3次,每次间隔2周。结果表明DNA疫苗pCA-optiHA可显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。三免2周后用107.45EID50的rPan09采用滴鼻方式进行攻毒,用Real-time PCR及制作肺组织石蜡切片检测DNA疫苗的保护效力。结果表明,pCA-optiHA免疫组的保护效力明显高于pCA-HA免疫组。本研究为进一步研究和设计有效的甲型流感病毒DNA疫苗奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒NS1蛋白核仁定位的研究

为研究2009年甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白的核仁定位情况,采用RT-PCR对其NS1基因进行了扩增,将其克隆至PEGX-KG载体,构建重组质粒KG-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白.然后采用GST柱亲和层析方法纯化NS1重组蛋白,免疫家兔来制备多抗,Western blot检测抗体.通过间接免疫荧光对表达不同长度NS1 (NS1-219、NS1-230、NS1-237)的3种重组流感病毒进行了核仁定位的研究,3种重组毒的NS1蛋白存在于细胞核和细胞质,但都不能定位于核仁,说明NS1蛋白的截短与否并不影响其核仁定位,其生物学意义有待于进一步研究.     

重组高产H1N1亚型猪流感疫苗株的构建与鉴定

为制备一株猪流感灭活疫苗的候选毒株,本研究利用反向遗传学技术,将A/swine/Guangdong/1/11(H1N1)毒株的HA、NA基因和A/PR/8/34毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重组,成功拯救出鸡胚高度适应性毒株rH1N1。抗原性分析显示rH1N1保留了亲本毒株良好的抗原性。rH1N1接种10日龄鸡胚48 h后,血凝价达到210,表明该毒株能在鸡胚中高水平复制。该毒株为H1N1亚型猪流感灭活疫苗的研制奠定了坚实的物质基础。     

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。     

腾冲红花油茶高接改造试验

2011年5月,采用13个优树无性系半木质化枝条为接穗、插皮嫁接或切接方法、塑料薄膜袋保湿、70%遮阳,对156株成年植株进行高接改造试验。嫁接后150 d调查统计,其株均成活率达94.2%,接穗芽成活率为55.0%,平均抽梢长度21.8 cm。高接改造取得良好效果,其技术可满足生产要求。     

3种不同方法对肉牛胴体性状预测能力的比较研究

本研究为了寻求一种对肉牛胴体性状预测准确性较高的方法,运用DPS数据处理系统和SAS软件比较偏最小二乘回归、GM(1,N)灰色系统和BP神经网络3种常用的预测模型对肉牛胴体性状的预测能力。选择肉牛7个宰前生长性状(体高、体长、胸围、腹围、管围、宰前活体质量、平均日增体质量),对2个重要的胴体性状(胴体质量和净肉质量)进行预测。结果表明:偏最小二乘回归方法在肉牛胴体性状预测方面准确性最高;GM(1,N)灰色系统和BP神经网络预测准确度偏低。本研究还将3种预测结果相结合,取其均值,大大提高了预测的准确性。这一研究将为肉牛生产实践提供一定的科学参考。     

饲粮不同采食水平下肉羊氮沉积和尿中嘌呤衍生物排出规律的研究

本试验旨在研究饲粮不同采食水平下肉羊氮沉积和尿中嘌呤衍生物(PD)的排出规律.试验选用12只平均体重为(41.3±2.8)kg的杜寒杂交绵羊公羔,随机平均分为3组,按照自由采食、自由采食量的70％和自由采食量的40％3个干物质采食水平饲喂,试验期为12d,其中预试期7d,正试期5d.结果表明:随着饲粮采食水平的降低,营养物质消化率均显著上升(P＜0.05),粪氮和尿氮排出量均显著降低(P＜0.05),沉积氮与摄入氮之间存在线性相关(R2=0.92).尿中PD排出量和微生物氮(MN)产量均随采食水平的降低而显著降低(P＜0.05),嘌呤氮指数(PNI)与氮沉积率和氮吸收率均表现出相同变化趋势.由此可见,PD排出量与可消化有机物采食量(DOMI)以及MN产量之间均存在线性相关,相关方程分别为y=21.41X-1.81(R2=0.94)和Y=0.91X+2.57(R2=0.94);PNI能够将氮平衡和PD排出量有机结合起来,用于评价饲粮氮的利用效率.     

H5N1亚型禽流感病毒A/Guangxi/1/2005株抗药机制的研究

为研究H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的抗药机制,本研究选取Clade2.3.4亚群中一株对金刚烷胺敏感的人源AIV A/Guangxi/1/2005(H5N1)(S-GX05),用抗流感病毒药物金刚烷胺对其进行定向诱导,筛选出一株抗药性病毒株,命名为R-A/Guangxi/1/2005(R-GX05)。通过全基因测序并与S-GX05全基因序列进行对比,结果显示S-GX05只在其M2蛋白中有一个氨基酸位点发生突变,即A30P;抗药性鉴定这两株病毒的半数药物抑制浓度(IC50)分别为0.9μM和48.9μM,表明R-GX05对金刚烷胺表现出一定程度的抗性。动物实验证实,这两株病毒对BALB/c小鼠的致病性基本一致,均表现出高致病性,其MLD50分别为4.7 log10 EID50和5.0 log10 EID50,两株病毒在小鼠体内各组织脏器中的分布及增殖能力也基本相同。这些结果表明,S-GX05在药物压力下产生抗药性后,并未引起其它生物学特性的改变。A30P的发现为进一步从分子水平上研究H5N1亚型AIV的抗药机制及新型抗流感新药的研发奠定了基础。     

5株H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析和豚鼠间传播能力的评估

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在哺乳动物间的传播能力,本研究以豚鼠为模型评价了5株H9N2亚型AIV在豚鼠体内的复制能力和水平传播能力,并分析了5株病毒血凝素(HA)蛋白的分子特征。结果表明,5株病毒均属于CK/Beijing谱系,其中2株病毒的HA具有人样受体特征(Lys226),2株病毒具有禽样受体特征(Gln226),而A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)株在该位点的氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe226)。裂解位点分析表明,5株病毒均具有低致病性AIV特征。个别病毒的潜在糖基化位点存在增加或缺失现象。感染试验表明,5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制。并且在鼻甲骨处复制稳定,平均病毒滴度为2.01 Log EID50/mL～4.5 Log EID50/mL。传播试验表明,所有病毒株的人工接种豚鼠的鼻洗液中均能够检测到病毒,最长排毒期为接毒后第8 d,而接触组豚鼠鼻洗液中未检测到病毒。本研究表明,5株H9N2亚型AIV均属于CK/Beijing谱系,部分病毒株的HA蛋白已具备人样受体结合特征,并且关键氨基酸位点(226位)处出现新的突变。5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制并通过上呼吸道排毒,但不能在豚鼠间同群传播。     

草坪草外源功能基因转化研究进展

草坪草的转基因技术已经有了很大的发展,目前已经在多种草坪草上转入了抗除草剂、抗病虫、抗旱抗盐、抗寒抗热和延长绿期以及抗重金属等外源的功能基因,获得了抗逆性提高的转基因植株。综合分析认为,在抗逆机理研究的基础上选择更关键的抗逆基因进行遗传转化、转化草坪草矮化和养分高效吸收的基因、转基因技术与传统育种方法相结合以及转基因草坪草的安全性评价是将来需要重点展开的研究工作。