鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株.其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1 024 000和1∶2 048 000;McAb 1A5和8H6 的相对亲和力分别为0.9 mg/L和0.7 mg/L.间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好.这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础.     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备与生物学特性的鉴定

用纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得2株稳定分泌抗BTV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1F5和4E5).其细胞培养上清ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水ELISA效价分别为1:512 000和1:128 000.亚型鉴定表明,1F5和4E5分别为IgGl和IgG2a.ELISA结果显示,2株单克隆抗体仅与BTV反应,不与其他相关病毒反应,表明2株单克隆抗体特异性良好.2株单克隆抗体1F5和4E5的相对亲和力指数分别为5.14×106mol/L和6.71×106mol/L.这2株单克隆抗体的获得为建立BTV免疫学检测方法奠定了基础.     

SYBR-Green实时荧光PCR检测转基因番木瓜

分别以RBCL基因和PRsV-cP基因、PRSV-RP基因为内源基因和目标基因，设计了3对特异性引物，对转基因番木瓜进行了SYBRGreen实时荧光PCR检测．结果表明，RBCL基因引物对所有供试样品成功扩增，0值为15～16，PRSV-CP引物对转PRSV-CP基因番木瓜样品成功扩增，Ct值为20～25，PRSV-RP引物对转PRSV-RP基因番木瓜样品成功扩增，Ct值为21～22．运用熔解曲线进行产物分析，验证了试验结果的特异性和准确性．     

4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血热病毒(EHDV)、阿卡斑病毒(AKV)、蓝舌病病毒(BTV)和水泡性口炎病毒(VSV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中BTV的VP7基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和VSV的NP基因序列进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针并标记生物素,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与这些病毒相应基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号建立了以上4种虫媒病的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到50~100个TCID50。本研究建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术,为其他类似病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。     

利用实时定量PCR研究不同蛋白质饲料对嗜淀粉瘤胃杆菌生长参数的影响

本试验主要研究不同蛋白质饲料对嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus)生长的影响.选用4只装有瘤胃瘘管的徐淮白山羊羯羊,分别饲喂以羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和鱼粉为蛋白质补充料的4组日粮,进行4×4拉丁方设计的试验,并采用实时定量PCR(RT-PCR)技术对嗜淀粉瘤胃杆菌进行定量分析.结果表明,豆粕组瘤胃氨氮浓度最高,并显著高于其他3组(P<0.05);细菌总数在组间差异不显著(P>0.05);嗜淀粉瘤胃杆菌的密度及其数量在细菌总数中的比例均以豆粕组最高,且组间差异显著(P<0.05).总之,豆粕饲料适宜于嗜淀粉瘤胃杆菌的生长,RT-PCR技术适用于瘤胃微生物的定量研究.     

毒麦及其近似种rDNA ITS-RFLP初步分析

本研究对毒麦属6个种的核糖体ITS进行PCR-RFLP分析,首次从分子水平上鉴定区分了毒麦属4个种（毒麦、亚麻毒麦、多花黑麦草、瑞士黑麦草）。根据这4个种ITS的测序结果,选取3种内切酶（BssSI、TfiI、NehI）应用于PCR-RFLP分析。根据酶切图谱可将4个近似种鉴别区分。为建立PCR- RFLP分子鉴定方法而有效地区分毒麦及近似种提供依据。     

猴B病毒抗体免疫梳检测方法的建立

为了研究猴B病毒(BV)抗体的快速检测方法,试验以采用基因工程技术制备BV的BV32基因原核表达产物重组BV32蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳(IC)方法用于特异性检测试验猴血清中抗BV的抗体IgG。结果表明:最佳抗原包被量为0.01 mg/m L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴B病毒阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应;能够敏感地检测到1∶400倍稀释的BV阳性血清;同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法对40份猴血清样品进行检测,与ELISA法检测结果一致率为98%,Kappa系数为0.997。说明免疫梳检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

含O型FMDVP1-2A、3CC基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMDI8-T载体,分别得到重组载体pUCll9-P1-2A和pMDI8-T-3C;将重组载体pUCll9-P1-2A用HindⅢ、BamH I酶切,重组载体pMDI8-T-3C用BamH I、Nhe I酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamH I酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMDI8-T-P1-2A-3C.,将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

毒麦属6个种的rDNA ITS序列测定及分析

提取毒麦属6个种的样品DNA,分别采用PCR产物直接测序和克隆测序2种方法,对毒麦属6个种rDNA的ITS区(包括ITS-1,5.8 S rDNA和ITS-2)进行序列测定.结果表明,毒麦属植物ITS序列总长度约为647 bp,其中ITS-1,5.8 S rDNA和ITS-2分别有16、7和7个变异位点.采用NJ法建立的系统发育树与形态学分类基本相符.     

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。