番木瓜的PRSV接种及其组培苗的RT-PCR检测

随着番木瓜环斑病毒病的加重,对番木瓜进行PRSV病毒接种,是有效防治PRSV和番木瓜抗PRSV重要措施之一.根据GenBank上已有的PRSV-CP基因序列,设计1对特异引物PRSVCP3/PRSVCP4,同时根据EF183499、HQ424465和美国夏威夷PRSV-CP序列设计保守区特异性引物PRSVCP1/PRS...     

7种番木瓜环斑病毒分离株外壳蛋白基因的克隆与序列比较

采用RT-PCR技术对我国海南、云南、广西和广东等不同番木瓜生产区的7个番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV-CP)进行克隆和鉴定分析。PRSV-CP编码区在864～873核苷酸之间,编码288～291氨基酸。对分离的7个PRSV-CP的核苷酸及氨基酸序列的比较结果表明大部分序列差异都处于N端,而各产区番木瓜PRSV-CP基因的3′端586～864bp区段,即278bpDNA片断的同源率最高,达到98.5%。这一同源序列的获得为利用植物基因工程培育广谱抗病性的番木瓜新品系奠定了基础。     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响,以组织培养的日升番木瓜为研究对象,以β-actin基因为内参基因,应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析,建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系,研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明,0.2%的禾生素及4.0g/L和1.0g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达,而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的增殖没有抑制作用。     

云南番木瓜花叶病病原鉴定*

 西双版纳、保山、楚雄以及玉溪等地的感病番木瓜叶片表现为花叶或褪绿,叶片畸形,果实表面布满不规则线纹、环纹及环斑等症状。对感病番木瓜材料进行了电镜观察,在电子显微镜下观察到800nm左右的病毒粒子;设计PRSV特异性引物对感病番木瓜材料进行RT-PCR检测,获得的扩增产物和引物设计大小相符;利用双生病毒特异性引物没有检测到双生病毒。确定引起云南番木瓜花叶病的病原为番木瓜环斑病毒。     

番木瓜性别连锁的AFLP及其SCAR标记的建立

 【目的】番木瓜（Carica papaya L.）是具有雌性、雄性和兼性性别分化,在热带和亚热带广泛种植的果树作物。番木瓜植株性别的早期确定对果园的建立具有重要意义。【方法】通过对与番木瓜性别连锁AFLP分子标记的克隆、测序和PCR引物设计,将31个与番木瓜性别连锁的AFLP分子标记转化为SCAR标记,并在具有不同性别分化的番木瓜植株和分离群体上进行验证。【结果】有16个SCAR标记在番木瓜雌性、兼性和雄性植株DNA样品上可扩增出多态性,在F2代分离群体上均与兼性性别共分离,可以有效地区分雌性株和兼性株或雄性株;另有15个SCAR标记在雌性、兼性和雄性植株DNA样品上没有扩增出多态性,不同性别DNA样品均扩增出相同大小的DNA片段。【结论】这些AFLP转化来的SCAR标记既可以作为与番木瓜性别连锁的分子标记进行早期性别分子诊断和分子标记辅助育种,又可以作为探针筛选番木瓜大片段基因组BAC文库,构建性别控制基因染色体区域的物理图谱。     

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.     

17个番木瓜品种(系)的RAPD分析

利用RAPD技术,从214个引物中筛选出能稳定扩增的16个引物,对17个番木瓜品种(系)进行了扩增,共扩增出120条谱带,77条具有多态性,多态性比例占64.17%.根据RAPD扩增结果,采用非加权成对平均数算法(UPGMA)对17个番木瓜品种(系)进行了聚类分析,结果表明,其遗传距离在0.06-0.23之间,在0.17水平上可以分为4类.     

17个番木瓜品种(系)的RAPD分析

利用RAPD技术,从214个引物中筛选出能稳定扩增的16个引物,对17个番木瓜品种（系）进行了扩增,共扩增出120条谱带,77条具有多态性,多态性比例占64.17%.根据RAPD扩增结果,采用非加权成对平均数算法（UPGMA）对17个番木瓜品种（系）进行了聚类分析,结果表明,其遗传距离在0.06-0.23之间,在0.17水平上可以分为4类.     

转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式 PCR技术检测

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和BAR基因,营养麦片扩增出内参RBCL基因和Cry1A(B)基因,在大豆精炼油、色拉油和玉米油中未检测出上述2种基因和另外3种外源基因CP4-EPSPS、BAR和PAT,其检测灵敏度为0.005%。结果提示,五重巢式PCR检测方法适用于转基因大豆、玉米和水稻深加工产品的定性检测。     

番木瓜CYP79A2基因片段的克隆与序列分析

苯丙氨酸氮羟化酶是植物中催化异硫氰酸苄酯(BITC)生物合成的第1个酶。笔者以番木瓜嫩叶总RNA反转录得到的cDNA为模板,依据拟南芥(NM-120608)和油菜(EU877074)的CYP79A2基因序列,并结合番木瓜的全基因组序列草图设计引物,进行PCR扩增,得到了大小为923bp的基因片段,命名为CP-CYP79A2。生物信息学分析结果表明,其为番木瓜的CYP79A2基因片段。为进一步研究番木瓜BITC的生物合成调控打下了良好的基础。     

用RT—PCR法对猪瘟病毒检测的研究

用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物(272bp)，并且不扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸；其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。     

陆川猪肌肉生长抑制素基因的克隆与序列分析

[目的]对陆川猪肌肉生长抑制素（MSTN）基因进行克隆及序列分析,为后期开展MSTN因表达与陆川猪肌肉生长发育及脂肪沉积的相关性研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已发表的猪MSTN因序列（NM 214435）设计引物,以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增MSTN因cDNA序列,扩增片段经纯化、克隆、鉴定和测序分析,并应用生物软件进行蛋白质二级结构预测.[结果]克隆得到陆川猪MSTN因编码区1128 bp,与GenBank已公布的约克夏、汉普夏、杜洛克、梅山猪、藏猪、广西巴马小型猪的基因同源性均在99.8％以上.陆川猪MSTN因第294位点存在特有的碱基G,但未引起氨基酸改变.蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪的MSTN成熟肽包含有α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲4种二级结构元件.[结论]猪MSTN因高度保守,可作为研究陆川猪肌肉生长发育和脂肪沉积的候选基因之一.     

番木瓜PL和β-Gal基因双价反义表达载体的构建

在已报道的番木瓜果胶裂解酶(PL)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因序列的基础上,设计特异引物,分别扩增保守区序列,将其分别反向插入植物表达载体pCAMB IA1301-35S-GUS-Nos的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建反义表达载体pCP和pCG.然后用2种不同的方法将带有完整启动子和终止子的PL和-βGal基因引入pCAMB IA2301中,获得PL和β-Gal基因的双价植物反义表达载体pCPG,并对2种方法进行比较.     

葡萄砧木‘5BB’PGIP基因的克隆及生物信息学分析

以葡萄砧木品种‘5BB’(Vitis berlandieri×V.riparia)为试材,通过设计特异引物、PCR扩增,从‘5BB’基因组中得到1条全长1002 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)基因序列,该序列包含1个完整的开放阅读框,与欧洲葡萄、其它果树的相应序列同源性分别为99%和68%,其推导的蛋白质序列中包含一段亮氨酸重复序列,第1~27个氨基酸残基是信号肽,三级结构与菜豆PG IP相似。     

微波消解-FAAS测定番木瓜不同部位的金属元素含量

为探讨番木瓜果肉、果皮、瓜籽中金属元素的含量,采用微波消解-FAAS法测定了番木瓜3个部位的K、Na、Ca、Mg、Cu、Fe、Zn共7种金属元素的含量,并对微波消解条件进行了优化。结果显示,在优化的微波消解条件下,样品消解完全、速度快、效果好,FAAS测定的各金属元素质量浓度与吸光度均呈良好的线性关系,相关系数r为0.995 7～0.999 9,检出限为0.002～0.131,回收率为98.30%～101.67%,RSD为0.20%～4.12%(n=6),说明测定方法可靠,结果稳定;番木瓜3个部位均含有较高的K、Ca、Mg,但Cu、Fe、Zn含量均较低,与番木瓜果肉相比,番木瓜果皮和瓜籽中K、Mg、Cu、Zn、Fe含量较高,食品和药品开发优势更突出。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

华南番木瓜病毒病及环斑病毒株系的调查鉴定

根据田间调查、病毒粒子和内含体形态、血清反应、寄主范围和症状、昆虫介体、物理性质、潜育期等试验结果、认为华南４省区的番木瓜病毒病只有ＰＲＶ一种。根据在西葫芦上的症状特点，将ＰＲＶ初步区分为４个株系，即Ｙｓ、Ｖｂ、Ｓｍ和Ｌｃ。在３１３份标样中，它们单独所占比例分别为４０．５７％，１０．２２％，０．６４％，４．４７％，Ｙｓ＋Ｖｂ（复合侵染）占４４．０８％，这表明Ｙｓ为优势株系，Ｖｂ次之，Ｌｃ和Ｓｍ发生少分布不广。研究结果还表明，以前有人报道的ＰＭａＬＶ实则是本研究的Ｖｂ，而不是一个新病毒。