斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

厚壳贻贝5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)基因克隆和时空表达

为探究5-羟色胺2A受体（5-HT 2A receptor， 5-HT2AR）基因在海水贝类生长发育中的作用，本研究通过RACE技术和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）克隆了厚壳贻贝5-HT2AR 基因的cDNA全长，并分析该基因的时空表达。结果显示，5-HT2AR基因全长2 636 bp，开放阅读框（ORF）2 124 bp，共编码707个氨基酸。序列分析结果显示该序列与人、小鼠、斑马鱼、长牡蛎和虾夷扇贝等物种分别具有45%、45%、48%、49%和67%的同源性。厚壳贻贝雌雄成体各组织和器官中均有5-HT2AR基因表达，雄性中的鳃表达量最高，而在雌性鳃、外套膜和性腺中的表达稍高于其他组织和器官；推测该基因可能与厚壳贻贝的摄食、对外界环境的感知及促进卵母细胞成熟有关。5-HT2AR基因在厚壳贻贝各发育阶段均有表达，且稚贝的表达量为眼点幼虫的1.4倍，推测5-HT2AR基因可能参与了调控厚壳贻贝幼虫的生长发育过程。本研究为进一步了解5-HT基因家族在双壳贝类中的功能奠定了基础。     

基于2b-RAD简化基因组测序的三门湾海域3种优势鱼类群体遗传多样性分析

为评估浙江省三门湾海域鱼类种质资源现状,采用简化基因组测序技术,对三门湾海域3种优势鱼种(白姑鱼Pennahia argentata、中华栉孔虾虎鱼Ctenotrypauchen chinensis和龙头鱼Harpadon nehereus)进行群体遗传多样性分析。结果表明,白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼、龙头鱼获得单核苷酸多态性(SNP)位点分别为125 225个、51 283个、55 128个,变异位点比例分别为1.74%、0.79%、0.54%,多态信息含量(PIC)分别为0.208、0.177、0.221,核苷酸多样性(P_i)分别为0.259、0.219、0.281。其中白姑鱼观测杂合度小于期望杂合度,显示出群体内纯合子较多,杂合子缺失;而中华栉孔虾虎鱼、龙头鱼观测杂合度大于期望杂合度,显示出杂合过度。3种鱼类群体以龙头鱼观测杂合度最高。综合以上SNP位点多样性、多态性信息含量、群体遗传多样性比较结果,三门湾海域3种鱼类群体变异位点比例均较低,相同群体的个体间遗传分化较小,遗传结构较稳定,总体上遗传多样性处于较低水平,应进一步加强资源保护和恢复。     

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析.结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6h后显著升高(P<0.05),表明md2表达量升高可能活化P53;8℃、6h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大.研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一.     

维生素B7和B12对细菌生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探究B族维生素对海洋细菌生物被膜形成、海洋贝类幼虫变态所产生的作用,本研究首先使用维生素B7 (VB7)和B12 (VB12)直接刺激厚壳贻贝(Mytilus coruscus)幼虫,观察其对变态的直接诱导活性;然后通过添加VB7和VB12,与海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)共同形成生物被膜,分析B族维生素对生物被膜形成及其生物学特性的影响;同时检测生物被膜变化对厚壳贻贝幼虫变态发育的影响。研究结果显示,0.02 mmol/L浓度VB7和VB12可以直接诱导厚壳贻贝幼虫的变态,且效果最为显著(P<0.05);0.02 mmol/L浓度VB7和VB12处理后的海假交替单胞菌生物被膜对幼虫附着变态的诱导作用均显著提高(P<0.05);进一步通过细菌密度计数、膜厚度分析、可拉酸染色和定量等方法,揭示VB7和VB12处理后生物被膜细菌密度、膜厚度以及胞外多糖、蛋白和脂质均显著增加(P<0.05)。研究结果证实,VB7和VB12可能通过改变海洋细菌生物被膜的生物学特性,进而调控厚壳贻贝幼虫变态发育。本研究为探究厚壳贻贝幼虫附着变态的分子机制提供了新的理论依据和创新思路,同时为B族维生素在提高厚壳贻贝人工育苗技术、改善厚壳贻贝养殖产业问题和促进海洋牧场生态修复建设等方面的应用提供了理论基础。     

鱼类应激应对策略及其在抗逆育种中的应用

发展现代水产种业,引领水产养殖绿色发展,成为未来水产养殖业可持续发展的保障。应鼓励产业选育推广优质、高效、多抗、安全的水产养殖新品种,由单纯高产品种转向适宜生态化、集约化养殖模式的优质高效、节料节药、抗逆性强、适应性广的品种。本文分析了当前水产种业存在的一些问题,剖析了优质、高效、多抗水产养殖品种的耐应激本质,围绕应激反应、应激恢复、应激应对方式在畜禽种业中的应用案例等,提出了环境限制育种理念和未来综合性抗逆育种技术发展方向,助推水产养殖业的可持续发展。     

不同温度下形成的深海菌膜对厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探讨深海细菌生物被膜对温度的适应性及对厚壳贻贝幼虫变态的影响,分别在4、18、25、37°C条件下培养生物被膜,调查温度对细菌密度、膜厚和胞外产物等生物学特性的影响,以及被膜对幼虫变态发育的影响。结果显示,4个温度条件下产生的生物被膜均可有效促进幼虫变态发育。其中,深海菌株Virgibacillus sp. 1在18°C时生物被膜的变态诱导活性最高(35%),且α胞外多糖含量较高,诱导活性与温度和细菌密度均显著相关;同时温度与其细菌密度和膜厚均显著相关。2株深海假交替单胞菌诱导活性与细菌密度均显著相关,温度仅影响Pseudoalteromonas sp. 33细菌密度。研究表明,3株深海细菌均有很好的温度适应性,且都能形成生物被膜;温度变化导致生物被膜的生物学特性改变,最终影响其对幼虫的诱导效果。     

弧菌生物被膜的动态演替对厚壳贻贝附着的影响

为探讨生物被膜动态演替过程中如何影响海洋无脊椎动物附着,实验选取了对厚壳贻贝附着具有不同诱导活性的弧菌Vibrio cyclitrophicus、V. chagasii和Vibrio sp. 22形成单一生物被膜,观察弧菌动态演替中生物被膜细菌密度、膜厚度和胞外产物等生物学特性变化,探究其对厚壳贻贝稚贝附着的影响。结果显示,弧菌生物被膜动态演替过程中,被膜细菌随着时间推移出现聚集现象,细菌密度和膜厚度也随着时间变化呈先增多后减少。除了Vibrio sp. 22,V. cyclitrophicus和V. chagasii生物被膜细菌密度和膜厚度与稚贝附着均有不同程度的相关性。所测弧菌生物被膜胞外产物的显微激光共聚焦结果分析发现,胞外多糖随着时间先增多,然后开始下降。相对比而言,胞外蛋白和胞外脂质无显著性变化。因而,胞外多糖变化规律与稚贝在被膜上附着变化相一致,表明胞外多糖是生物被膜动态演替过程中调控厚壳贻贝附着的重要因素。本实验初步探讨了生物被膜动态演替特征及其对厚壳贻贝稚贝附着的影响,对于后续进一步在海区开展生物被膜的动态演替与海洋底栖动物附着相互关系研究具有重要的学术价值,同时对于人工鱼礁礁体生物附着机理的研究具有重要的实践价值。     

条斑紫菜两个耐高温品系的耐低盐特性

以条斑紫菜两个耐高温品系(YZ-4和TM-18)为对象,以野生型品系(WT)做对照,分析其叶状体在高温、低盐胁迫下的生长和光系统Ⅱ最大光量子产量(F_v/F_m)的数值,为筛选既耐高温又耐低盐的条斑紫菜抗逆品系提供依据。结果显示,在适宜培养条件(温度18°C和盐度26)下,YZ-4和TM-18叶状体在50～85 d的生长速率快于WT,F_v/F_m和主要光合色素含量均高于WT,各品系的绝对生长率和F_v/F_m之间均具有较高的正相关性。另外,WT叶状体在70 d左右开始形成精子囊时,绝对生长率和F_v/F_m明显下降。在高温胁迫下培养,各品系叶状体的F_v/F_m和绝对生长率均呈下降趋势,且胁迫的温度越高或时间越长,其降幅越大。在24°C高温胁迫35 d后,WT、YZ-4和TM-18的F_v/F_m分别下降了56.7%、43.2%和28.7%。在25°C高温胁迫15 d时,WT的生长完全停滞,而YZ-4和TM-18则分别保持0.51和0.84 cm/d的绝对生长率,说明二者确实是耐高温的。低盐胁迫对叶状体的影响与高温胁迫的类似,在盐度为9的低盐下培养35 d后,WT、YZ-4和TM-18的F_v/F_m降幅分别为46.2%、42.0%和32.0%,三者的绝对生长率分别为0.12、0.10和0.90 cm/d。另外,WT和YZ-4在盐度为5时生长受到明显影响,叶状体在15 d时颜色加深、卷曲变硬并腐烂,而TM-18在相同盐度下培养25 d也未腐烂,F_v/F_m仍高达初始值的72.8%。这表明TM-18在高温或低盐胁迫下的耐受性比WT和YZ-4的都强,其内在原因是叶状体F_v/F_m的降幅较小,间接说明F_v/F_m可作为条斑紫菜抗逆品系选育的新指标。     

鳞头犬牙南极鱼LeptinB基因在抵御低温应激中的作用

为了探究瘦素基因(LeptinB, LepB)在斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)低温应激中的作用,本研究根据鳞头犬牙南极鱼(Dissostichus mawsoni) LepB基因(DM-LepB)编码的氨基酸序列,克隆到构建的pTOL2-actin-EGFP质粒中(启动子为斑马鱼的β-actin)。选取EcoRⅠ和BamHⅠ为限制酶,设计构建了pTOL2-LepB+HIS-EGFP表达载体,并转染至ZFL细胞中。选择致死温度10 ℃进行实验,采用流式细胞术检测了低温胁迫下细胞的存活率,使用增强型CCK-8试剂盒检测了低温条件下细胞的生长增殖情况,使用荧光探针DHE检测了细胞活性氧(ROS)含量。结果显示,LepB基因的过表达能有效减少细胞ROS的产生,减轻细胞凋亡以应对低温胁迫。分析还显示,DM-LepB的过表达也有利于维持低温刺激下的胞内ATP水平与线粒体状态,有效减轻低温刺激对细胞的凋亡和坏死作用,对细胞冷应激起到保护作用。采用油红O染色和甘油三酯(TG)实验检测发现,DM-LepB基因能减缓低温刺激时细胞脂质的消耗,较多的脂质保留可减弱低温刺激对细胞的伤害,使得细胞能更好地抵抗低温损害。研究结果为揭示南极鱼类的低温适应分子机制提供了基础资料。