猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断方法,试验根据GenBank中已发表的PEDV和TGEV的相关基因序列,设计合成特异性引物,分别进行单项PCR最佳反应条件的摸索;确定最佳反应条件后建立PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,并进行特异性分析;同时采用单项RT-PCR和二重RT-PCR法检测临床样本,比较两种方法的检出率。结果表明:试验成功建立了PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,经最佳退火温度摸索,二重RT-PCR法的最佳退火温度为58.1℃;经特异性分析,二重RT-PCR法对PEDV和TGEV具有很好的特异性;临床样本的检测结果显示,二重RT-PCR法与单项RT-PCR法检出率基本吻合。说明试验建立的PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法可用于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

福建地区部分猪场猪等孢球虫感染情况调查与分析

检测福建省9个地区的29个猪场1⁸周龄仔猪粪便样品2 173份,结果:猪等孢球虫(Isospora suis)阳性场28个,占检测猪场数的96.56%;猪等孢球虫卵囊总阳性率为9.76%(212/2173)。不同猪场间仔猪等孢球虫卵囊阳性率最高为27.78%,阳性猪每克粪便卵囊数(OPG值)在258周龄仔猪粪便样品2 173份,结果:猪等孢球虫(Isospora suis)阳性场28个,占检测猪场数的96.56%;猪等孢球虫卵囊总阳性率为9.76%(212/2173)。不同猪场间仔猪等孢球虫卵囊阳性率最高为27.78%,阳性猪每克粪便卵囊数(OPG值)在25¹15 100;卵囊阳性率与对数化的OPG值呈显著正相关(R=0.445,P=0.016)。福建省沿海6个地区的平均气温与猪等孢球虫的卵囊阳性率呈显著正相关(R=0.937,P=0.006)。第1至第8周龄仔猪等孢球虫卵囊阳性率2.66%115 100;卵囊阳性率与对数化的OPG值呈显著正相关(R=0.445,P=0.016)。福建省沿海6个地区的平均气温与猪等孢球虫的卵囊阳性率呈显著正相关(R=0.937,P=0.006)。第1至第8周龄仔猪等孢球虫卵囊阳性率2.66%¹7.46%,其中2周龄仔猪的OPG值经对数化后分析,显著高于其他周龄仔猪(P<0.01)。高床垫料饲养育成猪的等孢球虫阳性率和OPG值均极显著高于漏缝地板饲养的仔猪(P<0.01)。不使用抗球虫药物的猪场与使用其他抗球虫药的猪场仔猪的等孢球虫阳性率、OPG值均显著高于使用百球清的猪场(P<0.01,P<0.05)。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

转manA基因小鼠F1代表达效果的检测分析

将携带茁-甘露聚糖酶基因manA 的转基因FVB 原代小鼠与“生型FVB 小鼠进行繁殖得到F1代,通过 PCR 和Southern blot 鉴定出F1代转基因小鼠。提取转基因小鼠腮腺、舌下腺、下颌下腺、心脏、肝脏等组织的总RNA, 通过RT-PCR 检测出manA 在转基因小鼠的腮腺和舌下腺组织特异性表达。进行定量PCR 验证出manA 基因在302 号家系小鼠的舌下腺中表达量最高,证明茁-甘露聚糖酶基因manA 在转基因小鼠的腮腺和舌下腺特异性表达成功。 对转基因小鼠唾液进行收集测定茁-甘露聚糖酶活性,在302 号家系中检测到酶活性较高。通过代谢试验测定饲料 中粗蛋白、粗纤维和粗脂肪的消化率,结果显示,与非转基因小鼠相比,302 号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗纤 维的表观消化率无明显差异,而粗脂肪的消化率得到显著提高;304 号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗 纤维消化率方面均无明显差异。     

供体细胞系基因座位特异DNA 甲基化多态性 及其与猪克隆效率的关联分析

利用甲基化限制性酶切试验(Combined bisulfite restriction analysis, COBRA）和亚硫酸盐转换PCR (Bisulfite sequencing PCR , BSP）后测序的方法,筛选猪体细胞克隆优势供体细胞提供基因座位特异的DNA 甲基化 遗传标记。比较8 个发育重要基因的差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs）在不同克隆供体细胞系 中的DNA 甲基化多态性,并与猪克隆成绩进行关联分析。结果表明院除了XIST-DMR2 和H19-DMR3 DNA 甲基化变 异幅度较小(低于10%）外,其他基因的相关座位均存在一定的COBRA 多态性,其中,LINE1-DMR1、POU5F1-DMR1 和NANOG-DMR1 等3 个差异甲基化化区域在克隆效率最高细胞系中处均处于最低程度的DNA 甲基化状态,因此, 可作为筛选猪体细胞克隆优势供体细胞系的潜在的DNA 甲基化遗传标记。     

牛蜱龙岩分离株的分子鉴定

为了解福建省龙岩地区牛场体表蜱的种类,试验采集龙岩地区牛体表寄生蜱样本,基于蜱的核糖体rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列PCR扩增方法进行分子鉴定,获得ITS1和ITS2基因序列,进行blastn相似性搜索,应用MegAlign和MEGA 7.0软件完成同源性分析及种系发育分析。结果表明,该蜱ITS1序列与中国甘肃微小扇头蜱分离株同源性达99.32%(JQ737124.1、JQ737125.1),与中国湖南微小扇头蜱HAI2分离株同源性达99.16%(MK224531.1);ITS2序列与中国河南、南非豪登微小扇头蜱分离株同源性均为100%(KX450287.1、KY457506.1);种系发育分析结果显示,龙岩地区牛体表分离的牛蜱ITS基因序列与扇头蜱属ITS基因序列聚类,与革蜱属和璃眼蜱属处于两个不同的分支。说明福建龙岩牛蜱分离株为微小扇头蜱。     

欧洲型PRRSV的分离鉴定及其ORF5基因序列分析

采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,采用RT-PCR方法扩增PRRSV ORF5全基因并进行序列测定分析。从采集的病料中成功分离2株PRRSV,2株分离毒株ORF5与Gen Bank中选择的参考毒株比较发现,其核苷酸同源性为82.5%~90.6%,氨基酸同源性为80.6%~91.5%。通过序列进行系统进化分析均显示分离毒株属于欧洲型PRRSV,ORF5基因与LV相比变异较大,应加大对欧洲型PRRSV的监控。     

银杏叶提取物对肉仔鸡免疫器官指数及消化道局部体液 免疫球蛋白含量的影响

为研究银杏叶提取物(EGB)对肉仔鸡免疫器官指数及消化道局部体液免疫球蛋白含量的影响,选用360只1日龄健康AA肉用母雏,随机分成5组,每组6个重复,分别饲喂添加0、0.15%、0.20%、0.25%EGB或90 mg.kg-1金霉素的玉米-豆粕型日粮,试验期为42 d。结果表明,添加0.20%、0.25%EGB可显著提高42日龄肉仔鸡脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数(P<0.05),提高胆汁和肠液IgA、IgG、IgM含量(P<0.05),并且作用效果好于金霉素组(P<0.05)。可见,在该试验条件下,日粮中添加0.20%、0.25%EGB可促进肉仔鸡免疫器官的生长发育,提高消化道局部黏膜的体液免疫反应水平。     

银杏叶提取物对断奶仔猪小肠黏膜免疫屏障的影响

旨在研究银杏叶提取物(EGB)对断奶仔猪小肠黏膜免疫屏障的影响。将80头25日龄的"杜×长×大"三元杂交断奶仔猪随机分为2组,每组4个重复,每个重复10头;对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加0.2%EGB;试验期为28 d;测定断奶仔猪小肠黏膜免疫相关细胞数量、黏膜免疫球蛋白含量和细胞因子含量。结果表明,与对照组相比,日粮中添加0.2%EGB可显著提高断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量(P0.05),显著提高仔猪十二指肠、空肠和回肠黏膜Ig A、IL-2、IL-4、IFN-γ含量(P0.05)。本试验表明日粮中添加0.2%EGB可提高断奶仔猪小肠黏膜免疫屏障功能。     

猪瘟E2基因多克隆抗体的制备及其特性分析

以CSFV FJ-1株为模板对猪瘟E2基因的主要抗原表位进行PCR扩增,得到大小为370bp的目的片段,将其连接到pET-32a表达载体,转化BL21后利用IPTG诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,目的蛋白成功获得表达,大小约33.5ku融合蛋白。利用Ni-NTA agarose纯化蛋白、重组蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后免疫新西兰兔,多克隆抗体效价经间接ELISA检测可高达1∶6400。Western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性,试验结果表明已成功获得猪瘟E2基因的多克隆抗体且能识别CSFV FJ-1毒株。