犬疥（璊）副肌球蛋白抗血清的制备及临床应用

目的：利用现代分子生物学方法,建立一种准确率更高的犬疥（璊）病的诊断方法,为犬疥（璊）病的治疗提供诊断基础.方法：收集犬疥（璊）,抽提总RNA并将其反转录为cDNA;以该cDNA为模板,参考其它哺乳动物副肌球蛋白的基因序列特征,设计引物扩增含有多个抗原表位的犬副肌球蛋白的部分cDNA序列;构建原核表达载体,表达及纯化目的蛋白片段;以纯化的目的蛋白片段为抗原,免疫BALB/c小鼠制备抗血清;以制备的抗血清为一抗,通过间接ELISA法测定患病犬痂皮组织中疥（璊）副肌球蛋白片段的存在,进而判断是否有疥（璊）感染.结果：成功构建了副肌球蛋白的原核表达载体,命名为pET28a-Para-202;通过诱导、纯化获得了重组蛋白;该重组蛋白抗原免疫小鼠后获得高效价的抗血清;以该抗血清为工具,通过间接ELISA法极大提高了犬疥（璊）感染的诊断率,为该病治疗提供了重要的参考依据.     

上海市部分鸟类寄生蠕虫感染情况调查

为了解上海市鸟类寄生虫感染现状,于2012年从上海市部分花鸟市场分批购买了11科21种103只鸟,采用完全剖检法对鸟类消化道及各脏器进行寄生虫检查。结果显示,有14种33只鸟检出蠕虫,鸟种类的蠕虫感染率为66．67％（14／21）,鸟个体的蠕虫感染率为32．04％（33／103）,其中黄鹂、灰背鸫、灰喜鹊、丝光椋鸟、喜鹊、野鹌鹑等6种鸟的检出率较高,感染率为60％～100％。在检出蠕虫的14种33只鸟中,共检获蠕虫932条,其中从9种16只鸟检获吸虫268条,从8种17只鸟检获绦虫631条,从7种12只鸟检获线虫17条,从4种7只鸟检获棘头虫16条。在检获的932条蠕虫,分别来自肺脏、肾脏、肝脏（胆囊）、肠道,而在心脏、气管、胃、皮下等组织器官未检出蠕虫。肠道是寄生虫寄生的主要场所,从27只鸟的肠道检获746条蠕虫,分别占阳性鸟和蠕虫数的81．82％（27／33）、80．04％（746／932）;其次为肝脏（胆囊）,从8只鸟的肝脏（胆囊）检获182条蠕虫．分别占阳性鸟和蠕虫数的24．24％、19．53％。在感染强度上,野鸽子和鸟灰鸫的蠕虫感染强度最高,平均每只分别检出171条和123条,其次为灰背鸫（53条／只）。调查结果表明,上海市鸟类寄生虫的种类多,且蠕虫的各大类（吸虫、绦虫、线虫、棘头虫）均有检出,依据检获的虫体数量,绦虫和吸虫是鸟类的主要寄生虫,调查结果为初步掌握上海市鸟类寄生虫的感染现状、做好鸟类寄生虫病的防控提供了基础数据。     

新城疫病毒LaSotaC5株感染性克隆的构建及病毒拯救

将本实验室保存的一株LaSota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代5次后筛选到1株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为LaSotaC5,并对其进行全基因组测序,克隆株与亲本株在生物学特性与基因序列上都存在一定的差异。参照LaSotaC5株全基因序列单酶切位点,用RT-PCR的方法将基因组分8段扩增,按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,成功构建含有病毒全长eDNA的转录载体TVT．LaSotaC5。将TVT-LaSotaC5与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI—L共转染BSR—T7／5细胞,成功拯救出了具有感染性的LaSota株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。     

副溶血弧菌SHJLA株的分离鉴定及致病性分析

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是海洋环境中常见的食源性致病茵。本研究从对虾中分离出1株细菌SHJLA,在TCBS和弧菌显色培养基上分别显示典型的蓝绿色和紫红色的菌落,且其生理生化特性具有典型副溶血弧菌的特性。以SHJLA菌株的基因组为模板。检测副溶血弧菌种特异性基因（tlh、toxR、groEL）均为阳性,gyrB基因序列分析表明SHJLA与副溶血弧茵的亲缘关系最近,同源性达98％～100％;检测副溶血弧菌主要毒力相关基因tdh和T3SS2（VopC2和vcrD2）均为阳性。该菌的神奈川溶血实验为阳性,对小鼠的半数致死量（LD50）为4．8×10^8 cfu／mL。结合SHJLA菌株的形态、生理生化、种特异性基因的检测、gyrB基因序列分析、毒力相关基因的检测以及小鼠半数致死量的测定结果,确定SHJLA是一株携带毒力基因的副溶血弧菌。     

Vpg在单股正链RNA病毒生命活动中的作用

在多种动、植物单股正链RNA病毒基因组的5'末端往往共价结合一个小分子Vpg蛋白,它可以与多种病毒蛋白或宿主细胞因子相互作用,并形成复合物,参与了病毒的翻译、复制或致病等基本生命活动,研究该蛋白的结构与功能对于阐述单股正链RNA病毒的生命本质具有重要意义,本文对近年来的相关研究进展进行了概括介绍。     

H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型,因而对其进行病毒的监测与诊断显得极其重要。通过比对GenBank上H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了一个特异性针对H9 AIV HA的探针。特异性和扩增曲线实验结果显示,该探针具有较好的扩增效率,且仅特异性识别H9亚型AIV。通过重组质粒pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。实验结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法敏感性能达到100个DNA拷贝数,比传统PCR方法检测敏感性提高了1000倍。此外,本方法还能检测到10EID50个病毒,比传统PCR方法检测敏感性也提高了1000倍。通过批间和批内试验,结果表明,这两个试验的变异系数分别小于5%和1%,说明本研究的方法具有较好的重复性。此外,通过检测人工感染动物咽拭子,结果表明H9亚型AIV荧光定量PCR方法比传统PCR的方法检测敏感性提高了100倍。在临床样品的检测中,H9亚型AIV荧光定量PCR方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了大约30%。综上所述,本研究所建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确性和敏感性,对H9亚型禽流感疫情防控及其流行病学调查具有积极的科学意义。     

我国鸟类原虫种类与感染状况研究进展

原虫是寄生于鸟的一类常见寄生虫,不仅危害鸟的生长发育,还对人类健康存在潜在威胁。为了解我国鸟类原虫种类与感染状况,作者查阅了近几十年我国在鸟类原虫调查方面的文献。经归类整理,在我国鸟类中共发现原虫70种,隶属于3门、4纲、5目、9科、12属。其中,顶器复合门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、真球虫目（Eucoccidiorida）的原虫有26种,包括艾美耳科（Eimeiridae）的艾美耳球虫属（Eimeria）20种和等孢球虫属（Isospora）2种、隐孢子虫科（Cryptosporidiidae）的隐孢子虫属（Cryptosporidium）3种、住肉孢子虫科（Sarcocystidae）的弓形虫属（Toxoplasma）1种;孢子虫纲、血孢子虫目（Haemospororida）的原虫39种,包括疟原虫科（Plasmodiidae）的疟原虫属（Plasmodium）23种和血变虫属（Haemoproteus）1种、住白细胞虫科（Leucocystozoidae）的住白细胞虫属（Leucocytozoon）15种;肉足鞭毛门（Sarcomastigophora）、动物鞭毛虫纲（Zoomastigophora）、毛滴虫目（Trichomonadorida）的原虫2种,包括单尾滴虫科（Monocercomonadidae）的组织滴虫属（Histomonas）1种、毛滴虫科（Trichomonadidae）的毛滴虫属（Trichomonas）1种;肉足鞭毛门、叶足纲（Lobosasida）、阿米巴目（Amoebida）、内阿米巴科（Entamoebidae）的原虫2种,即内阿米巴属（Entamoeba）1种和内蜒阿米巴属（Endolimax）1种;芽囊原虫新亚门（Blastocysta）、芽囊原虫纲（Blastocystidea）、芽囊原虫目（Blastocystida）、芽囊原虫科（Blastocystidae）的芽囊原虫属（Blastocystis）1种。球虫、疟原虫、隐孢子虫是鸟类中的常见原虫,球虫、疟原虫、血变虫、毛滴虫在鸟中的感染率较高,隐孢子虫、弓形虫、阿米巴、芽囊原虫等为可感染人类的原虫。了解我国鸟类的原虫种类与感染状况,对做好鸟类原虫病的防控和保护鸟类具有十分重要的指导意?     

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

上海地区家鸭球虫种类初步调查

为初步了解上海地区家鸭的球虫种类,本试验从上海市郊8个鸭场采集鸭粪便,实验室离心、分离球虫后,经2.5%重铬酸钾溶液培养至孢子化.用带SPOT拍摄系统的显微镜观察、拍摄孢子化卵囊,记录其大小、面积以及卵囊内部结构,并对照文献进行种类初步鉴定.鉴定结果显示,上海地区家鸭的球虫有3属10种,即艾美耳属(Eimeria)6种、温扬属(Wenyonella)3种、等孢属(Isospora)1种.本调查结果为有效防治鸭球虫病提供了基础资料.     

犬结核SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立

本研究基于IS1081基因建立了鉴定犬结核的SYBR Green荧光定量PCR方法.在最佳反应条件下反应效率为1.09,获得的标准曲线相关系数R值达0.999 5,标准曲线的线性范围达到1～1×107拷贝8个数量级,最低可检测到约10个目的拷贝,即31.4 fg DNA.根据溶解曲线分析,扩增产物中无引物二聚体的影响,说明所设计引物特异,退火温度合适.这表明本研究建立的SYBR Green荧光定量方法灵敏度高、定量范围广.利用该方法对临床样品进行检测,结果发现:与结核杆菌分离培养方法比较,符合率为85%.240份犬猫鼻拭子中150份被检测为阳性,这说明犬猫鼻腔中分枝杆菌携带率很高.