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影响A型流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】流感病毒样颗粒在病毒学研究和新型疫苗开发方面发挥着巨大作用。本研究旨在建立一种简便的包装病毒样颗粒的方法来阐明影响流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白。【方法】构建同时表达HA、NA和M1 3个蛋白,同时表达HA和NA两个蛋白以及只表达HA蛋白的真核表达质粒,然后转染293 T细胞,检测细胞培养上清血凝效价初步判断是否包装并释放出病毒样颗粒,并采用透射电子显微镜观察病毒样颗粒的形态。【结果】表达HA和NA或表达HA、NA和M1蛋白的真核表达质粒转染293 T细胞后,检测细胞上清血凝价均为24 ;而转染单独表达HA蛋白质粒的细胞上清没有血凝活性。电镜观察表明单独表达HA蛋白没有可见的病毒样颗粒,而表达上述两个或3个蛋白均可观察到病毒样颗粒。【结论】本研究采用同时表达多个结构蛋白的真核表达载体来研究病毒样颗粒包装及释放的必须蛋白,研究结果表明M1在病毒样颗粒包装及释放过程中是非必须蛋白,而NA和HA蛋白是影响流感病毒样颗粒形成及释放的关键蛋白。 相似文献
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H9N2亚型禽流感疫苗在我国普遍使用,在强大免疫压力下,H9N2亚型禽流感病毒变异加快,现有商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒流行株的感染。为此,本研究以从近期流行毒株中筛选出的一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)(简称为SH441)为种毒,制备灭活苗,进行了最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究。将制备的H9N2亚型禽流感灭活苗以0.01、0.02、0.04、0.05、0.08 mL/只的不同剂量,胸部肌肉途径免疫3周龄SPF鸡只,并于免疫后21天静脉感染SH441病毒,结果显示该疫苗最小免疫剂量为0.02 mL/只。以0.05 mL/只剂量免疫SPF鸡只,该疫苗能刺激SPF鸡只产生较高的HI抗体滴度,且在免疫后第5周达到峰值(12 Log2以上),随后稍有下降但保持相对稳定,且在免疫后29周时依然保持在7 Log2以上。这些结果为为该疫苗的进一步开发奠定了良好的基础。 相似文献
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应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒 总被引:4,自引:0,他引:4
鸭坦布苏病毒是新发现的一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的黄病毒。目前尚无可靠的快速诊断方法用于该病毒的检测。本研究根据鸭坦布苏病毒E基因序列,设计了2对重叠引物P1、P2和P3、P4,建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法,该套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省、上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测,阳性检出率为48/63(76.2%),而病毒分离率仅为13/63(20.6%)。由此表明,与其他方法相比较,本试验所建立的套式RT-PCR方法具有快速、敏感、特异优点,可用于鸭坦布苏病毒的流行病学调查及病毒的检测。 相似文献
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H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测其血凝效价。经序列比对,拯救获得的病毒rSH1的8个基因片段序列均与亲本病毒SH1的序列相同。实验结果表明,本研究成功建立了H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为该病毒的致病机理和传播机制研究等奠定了技术平台。 相似文献
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本研究用纯化的H9N2亚型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞:3G8、2F6、5F2。间接ELISA方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上。构建了真核表达载体pCAGGS-M1并转染于MDCK细胞,以用于腹水的Western blot和间接免疫荧光鉴定。间接免疫荧光结果表明,3株单克隆抗体皆与真核表达蛋白M1反应。这些单克隆抗体的制备为后期研究M1蛋白在流感病毒复制与出芽过程中的重要生物学功能奠定了基础。 相似文献
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本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。 相似文献
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禽流感病毒不仅严重危害养禽业,而且给公共卫生造成巨大威胁。禽流感病毒与哺乳动物流感病毒发生重组是造成数次流感大流行的重要前提。本研究利用H9N2亚型禽流感病毒(A2093株)和WSN的反向遗传操作系统,用A2093株的膜蛋白基因(HA基因和NA基因)与某个聚合酶或NP基因替换WSN的相应基因,获得了r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN四种重组病毒,在MDCK、DF1、A549三种细胞系进行了病毒生长曲线的测定,并研究了这些病毒在小鼠体内的复制能力。结果显示,0.001 MOI的剂量感染不同细胞后,病毒滴度均在感染后24 h达到峰值;在3种细胞上r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN均表现出较强的复制能力。在小鼠体内,4株重组病毒的复制能力均介于亲本毒A2093和WSN之间,在肺脏中4株重组病毒的复制能力相似,但在鼻腔中r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN的复制能力明显高于r2093HANAPB2/WSN和r2093HANANP/WSN。研究结果表明,与禽流感病毒的不同聚合酶或NP基因重组产生的新病毒,其复制能力具有明显差别,造成这种差异的分子机制值得进一步研究。 相似文献
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鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和DTMUV,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对DTMUV-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在DTMUV诊断和杭原分析中发挥重要作用。 相似文献