CD31可作为分离纯化猪肝窦内皮细胞的标记分子

血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)是内皮细胞表面一种重要的膜分子,常作为特异性标记鉴定内皮细胞.然而,CD31是否可作为纯化猪(Sus scrofa)肝窦内皮细胞(porcine liver sinusoidal endothelial cell,pLSEC)的特异性标记还有待验证.本实验通过CD31流式分选分离纯化pLSEC,观察分离后的pLSEC是否具有标志性的窗孔结构.以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的五指山小型猪为研究材料,采用胶原酶原位肝脏灌注、离体消化,Percoll梯度离心,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-CD31标记pLSEC进行流式分选.结果表明,分离得到的pLSEC在倒置显微镜下细胞呈典型的内皮细胞形态,铺路石样排列;通过透射电镜观察到细胞具有窗孔结构,通过环境扫描电镜观察到pLSEC与猪主动脉内皮细胞(porcine arterial endothelial cell,pAEC)细胞表面结构具有明显区别,pLSEC具有特殊的窗孔结构.利用实时荧光定量PCR检测pLSEC、pAEC和猪耳成纤维细胞(porcine ear fibroblast cell,pEFC)的CD31、细胞粘附因子(cell adhesion molecules,CD146)、血友病因子Ⅷ基因(hemophilia factorⅧ,Ⅷ-F)、血管性血友病因子基因(von willebrand factor,vWF)的表达.结果表明,pLSEC的CD31、CD146、Ⅷ-F和vWF表达量显著高于pAEC和pEFC.利用免疫荧光法检测到pLSEC具有摄取细胞膜红色荧光探针(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein,Ac-LDL)的内吞功能.总之,利用CD31分离纯化的pLSEC,具有典型窗孔结构和内吞功能,同时高表达CD146、Ⅷ-F和vWF等肝窦内皮细胞的标记分子,为进一步研究异种肝移植的血小板减少症的问题提供了良好的细胞材料.     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10% DMSO和5% DMSO+5% PVP组细胞存活率最高,与对照组相比差异不显著（P＞0.05）,其它各试验组复苏细胞存活率均显著低于对照组（P＜0.05）;各试验组中10% DMSO组细胞增殖能力最强,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;细胞复苏后培养6 d,各试验组脂肪沉积量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）,而第11天时,10 % DMSO组脂肪沉积量显著高于其它试验组（P＜0.05）,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;各试验组GPDH活性和LPL、PPARγ mRNA 的表达量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）;染色体核型分析发现,复苏细胞二倍体细胞占主体,与原代细胞没有显著差异（P＞0.05）。【结论】含20% FBS的DMEM/F12培养液中添加10% DMSO或10%PVP、5% DMSO+5% PVP均能有效保存绵羊前体脂肪细胞,但以10% DMSO最佳。     

五个地方绵羊品种FAS基因3'-UTR区单核苷酸多态性研究

[目的]探究脂肪酸合成酶(FAS)基因3'端非翻译区(3'-U7R)在绵羊地方品种中的遗传多态性,为进一步揭示地方绵羊品种间遗传分化、开展肉质性状的关联分析和表达调控等研究提供依据.[方法]采用PCR-SSCP和DNA测序技术对兰州大尾羊(38只)、滩羊(58只)、甘加羊(40只)、欧拉羊(30只)和乔科羊(39只)五个地方绵羊品种205只个体的脂肪酸合成酶(FAS)基因3'-UTR进行单核苷酸多态性(SNPs)检测和遗传多态性分析.[结果]在这五个地方绵羊品种的FAS基因3'-UTR区中,有951位点和1005位点2个多态位点;两位点分别存在AA、Aa、aa和EE、Ee、ee各三种基因型,而aa和ee基因型未检测到;AA和EE基因型频率高于Aa和Ee基因型频率,基因型AA和EE为优势基因型;A和E两个等位基因频率高于a和e等位基因频率,为优势等位基因,适合性检验表明,这5个地方绵羊品种在951位点和1005位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态.独立性检验表明:在951位点,兰州大尾羊与滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊之间表现为差异显著(0.010.05);在1005位点兰州大尾羊、滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).测序结果表明,951位点在FAS基因在其转录产物Mrna的951位所对应处有一处C→T突变;1005位点在FAS基因在其转录产物Mrna的1005位所对应处有一处A→G突变.FAS基因Mrna二级结构预测结果显示:951位点的突变能导致其二级结构发生了明显的改变,而1005突变不会改变其二级结构.[结论]五个地方绵羊品种在FAS基因3'-UTR区有951位点(C→T)和1005位点(A→G)两个SNPs,2位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态;基因型频率分布的独立性检验结果表明,在951位点,兰州大尾羊与滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊之间表现为差异显著(0.010.05);在1005位点兰州大尾羊、滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).     

兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP） 基因克隆及其同源性比较

【目的】克隆兰州大尾羊心脏型肪酸结合蛋白（H-FABP）基因全长cDNA序列,为研究绵羊H-FABP生物学作用和生产应用提供理论依据。【方法】根据已知哺乳动物H-FABP基因 cDNA 序列,设计5''和3''特异引物,运用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得兰州大尾羊H-FABP基因全长 cDNA 序列。【结果】 扩增获得兰州大尾羊5''端425 bp、3''端231 bp片段和 177 bp中间片段,拼接获得748 bp兰州大尾羊H-FABP基因全长cDNA 序列（GenBank登录号：JQ780322）。 兰州大尾羊H-FABP基因ORF长 402 bp,编码 133 个氨基酸。核苷酸序列分析显示兰州大尾羊H-FABP基因序列与大多数哺乳动物相似,但其第66位发生的碱基转换（T←→G）引起所编码的第22位天门冬氨酸（N）不同于其它所有物种的赖氨酸（K）。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与山羊亲缘关系最近。预测兰州大尾羊H-FABP蛋白质的空间结构与山羊和牛H-FABP类似,由2个α螺旋和10个反向平行的β折叠组成,10 个折叠片围成一个桶状结构,疏水性残基位于桶内,用于结合脂肪酸。【结论】克隆了兰州大尾羊H-FABP基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

硫酸软骨素的研究概况

硫酸软骨素是从动物软骨素中提取的黏性多糖。在医药、化妆品和食品工业上具有广泛的用途,市场前景广阔。作者介绍了硫酸软骨素的来源、结构、性质及其生理功能,并对硫酸软骨素的提取分离纯化技术进行了综述。     

不同尾型绵羊生产性能、屠宰性能、肉品质和脂肪酸组成的比较

为了研究不同尾型绵羊生产性能、屠宰性能、肉品质和脂肪酸组成的差异,选择相同饲养管理水平下8月龄兰州大尾羊(Lanzhou fat-tailed sheep)、小尾寒羊(Small-tailed han sheep)、藏羊(Tibetan sheep)的羯羊各6只,测定生产性能后进行屠宰试验,检测尾部脂肪的脂肪酸组成,并将生产性能与屠宰性能指标进行相关性分析。结果表明:兰州大尾羊的体长、体高和尾型相关指标极显著高于小尾寒羊和藏羊,兰州大尾羊和藏羊的胸围、胸深、胸宽、尻宽显著高于小尾寒羊;兰州大尾羊的宰前活质量和胴体质量显著高于藏羊,极显著高于小尾寒羊;兰州大尾羊和藏羊的屠宰率比小尾寒羊分别极显著高出15.50%和15.62%,净肉质量和骨质量显著高于小尾寒羊;小尾寒羊肉的剪切力为(0.30±0.12)kg·f,极显著低于兰州大尾羊和藏羊。3种羊尾部脂肪中共检测到36种脂肪酸,小尾寒羊的饱和脂肪酸相对质量分数极显著高于兰州大尾羊和藏羊,不饱和脂肪酸相对质量分数极显著低于兰州大尾羊和藏羊。兰州大尾羊的体高与宰前活质量、眼肌面积呈极显著正相关,胸深与宰前活质量、胴体质量、净肉质量和眼肌面积呈显著正相关。3个品种羊宰前活质量与胴体质量、净肉质量等产肉力指标呈显著正相关。表明在相同舍饲营养水平下,3个品种羊生产和屠宰性能综合表现为:兰州大尾羊藏羊小尾寒羊,藏羊的肉质表现出失水率低、肉色深、剪切力大、熟肉率高等特点,兰州大尾羊的尾部脂肪营养价值最高。     

一例禽霍乱的诊断和治疗

禽霍乱是由巴氏杆菌引起的主要侵害鸡、鸭、鹅等禽类的一种急性接触性败血性传染病。2016年6月17日,笔者从农户处收购的散养鸡集中饲养1周后发病,死亡19只。经临床诊断、病理诊断和实验室诊断,确诊为禽霍乱,笔者对该起禽霍乱的治疗和预防进行了总结、分析。     

绵羊溶血性曼氏杆菌灭活疫苗免疫效果观察

溶血性曼氏杆菌主要引起牛羊等反刍动物的呼吸系统疾病,2006年,康乐县某养殖场的部分小尾寒羊发生了厌食、腹泻、咳嗽、高烧、流产等症状的传染性疾病.经采取死亡羊只的脾脏、肝脏、胎盘等病料,进行了实验室诊断,确诊为溶血性曼氏杆菌引起的曼氏杆菌病.为有效控制曼氏杆菌病,我们开展了灭活苗免疫效果的观察.     

胰腺特异性表达载体PDX1-eGFP构建及体外验证

为了研究胰腺发育与缺陷的转基因特异性表达系统,探索胰腺特异性表达载体的构建并进行体外验证。以增强型绿色荧光蛋白(e GFP)为报告基因,小鼠PDX1启动子为特异性启动元件,构建胰腺特异性启动e GFP表达载体PDX1-e GFP,载体转染MIN-6胰岛β细胞和猪耳成纤维细胞,培养48 h后,进行荧光观察和RT-PCR、Western blot检测。结果显示,e GFP在MIN-6胰岛β细胞中的RNA水平和蛋白水平均表达,而在非胰腺细胞猪耳成纤维细胞中均不表达。本研究结果表明,成功获得胰岛特异性表达载体PDX1-e GFP,为构建相关基因在胰腺中特异性表达的载体提供依据,为制备胰腺缺陷动物奠定基础。     

牦牛胚胎发育早期部分器官组织形态学观察

为了研究牦牛胚胎发育早期部分器官的形态学与组织学变化,试验采集1~4月龄牦牛胚胎,制作肾脏和性腺的组织切片,用光学显微镜进行观察测量。结果表明:与1月龄后期相比,4月龄牦牛胚胎体长增加了4倍,体重达到245.60 g,心脏、肺脏重量增加比肝脏快。卵巢皮质中分布有大量原始生殖细胞,随着月龄增加,髓质中红细胞、梭状细胞增多。睾丸中先有两种不同的原始生殖腺管腔,之后逐渐分化生成生殖小管。肾脏周围被被膜包裹,2月龄牦牛胚胎被膜上有脂肪细胞,月龄较小的胚胎肾小球内红细胞较少,肾小囊较宽,4月龄牦牛胚胎肾脏皮质、髓质分界清楚,有肾乳头形成。