卵母细胞和供核细胞对体细胞克隆的影响

克隆胚胎发育率太低和后代缺陷率高是克隆不能广泛应用于畜牧生产和生物医药的最大障碍.影响克隆效率的因素很多,过去20多年主要集中于改进和完善核移植程序方面.     

原始生殖细胞的人类ES细胞的分离克隆

本研究收集47例4-13周龄人流产胎儿分离PGCs，采用与其生殖嵴/腺或类似物胎儿成纤维细胞共培养的方式，获得了具小鼠ES细胞或EG细胞特征的人类ES细胞，该类细胞在体外可自发分化为类胚体，成纤维细胞样细胞，神经胶质细胞样细胞及心脏跳动样细胞团等，同样方法自4例大于17周龄胎儿未观察到人类ES细胞，研究表明，采用共培养法可以从4-13周龄流产儿的PGCs分离克隆到人类ES细胞，最适宜胎龄为7-10周龄。     

小鼠胎儿和牛睾丸成纤维细胞的冷冻保存

研究了冷冻保护液、平衡时间、降温速度、解冻液以及解冻方式对冷冻小鼠胎儿成纤维细胞和牛睾丸成纤维细胞活力的影响。结果表明,对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻,冷冻液Ⅱ（０．４％ＢＳＡ）＋１．５ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．１ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的ＰＢＳ液）的冷冻效果优于冷冻液Ⅰ（１０％的ＮＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ液）。用冷冻液Ⅱ对小鼠胎儿成纤维细胞和犊牛睾丸成纤维细胞进行冷冻,平衡时间可从２．     

密闭气袋在牛卵母细胞体外成熟培养中的应用

通过简易避光密闭气袋在人体呼出的气相环境下（CO2浓度约5%,O2浓度约15%）,利用生化培养箱进行牛卵母细胞的体外成熟培养。结果显示,牛卵母细胞在密闭气袋中培养与对照组（正常培养）相比成熟率（74.79%比71.69%,P〉0.05）、孤雌激活后卵裂率（83.07%比81.39%,P〉0.05）和囊胚发育率上（26.75%比22.87%,P〉0.05）均无显著差异,但是密闭气袋培养各项数据均略高于对照组。本试验验证了该技术的方便性和有效性,为此技术在生产实践中的推广应用提供依据。     

牛胚胎在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的生长行为

 比较了牛胚胎与小鼠胚胎在体外培养过程中的生长行为，结果表明，牛滋养层细胞与内细胞团（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌｍａｓｓ，简称ＩＣＭ）连接不紧密，其迅速增殖，形成半透明囊腔结构；小鼠胚胎滋养层与ＩＣＭ密切相连，形成盘状结构，并推移原代小鼠胎儿成纤维细胞（Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＰＭＥＦ）饲养层。牛ＩＣＭ形态呈现多样性，表现为团状、条状、网状和混合型；小鼠ＩＣＭ形态单一，多呈圆盘状。体外培养的牛胚胎发育速度比小鼠胚胎迟缓，牛ＩＣＭ初次传代时间为胚胎体外培养开始后５～６ｄ，小鼠ＩＣＭ初次传代时间为胚胎体外培养后３～４ｄ。牛ＩＣＭ分化程度由小到大依次为团状ＩＣＭ、条状ＩＣＭ、混合型正 和网状ＩＣＭ。牛和小鼠胚胎附着率及ＩＣＭ克隆率由大到小均依次为孵化胚、囊胚和桑褡胚，但桑褡胚和囊胚附着率和ＩＣＭ克隆率均无显著差异（Ｐ＞０．０５）。与全胚相比较，牛和小鼠裸胚（无透明带或透明带不完整的胚胎）贴壁时间提前，但ＩＣＭ形成率和ＩＣＭ的生长行为均无显著差异；小鼠和牛桑椹胚卵裂球（中、晚期）体外分化抑制培养，形成亚囊胚而不能获得 ＥＳ细胞；剥离牛胚胎滋胚层细胞，ＩＣＭ细胞更易分化。     

卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。     

牛卵泡卵母细胞的体外成熟培养

1997- 12～ 2 0 0 1- 0 8共进行了 97批牛卵母细胞体外成熟试验 ,总成熟率为 70 .75 % (35 6 1/ 5 0 33)。其中培养液为 TCM199+0 .12 g/ L 丙酮酸钠 +10 mm ol/ L Hepes+体积分数 8% NCS+10 mg/ L FSH+10 mg/ LL H+1mg/ L E2 (培养液 1组 )组进行 5 0批试验 ,成熟率为 6 5 .75 % (14 15 / 2 15 2 )。培养液 1组有 5批次未添加 Hep-es 盐 ,其成熟率为 75 .2 1% (88/ 117) ;另 4 5批次添加 Hepes盐 ,成熟率为 6 5 .2 1% (132 7/ 2 0 35 )。培养液为TCM199+体积分数 8%发情牛血清 +0 .12 g/ L 丙酮酸 (培养液 2组 )组进行 4 7批次试验 ,成熟率为 74 .4 9%(2 14 6 / 2 881)。培养液 2组中有 9批次添加了 4 0 m g/ L 的庆大霉素 ,其成熟率为 72 .15 % (342 / 4 74 ) ;另 38批次未添加庆大霉素 ,其成熟率为 74 .95 % (180 4 / 2 4 0 7)。试验同时表明 ,激素来源对卵母细胞成熟率无显著影响