PCR技术检测猪伪狂犬病毒及其潜伏感染部位的研究

本研究合成了伪狂犬毒糖蛋白ｇｐ５０基因引笺，该引物能够扩增糖蛋白ｇｐ５０基因中４３４－６５１之间的２１７ｂｐＤＮＡ片段，该片段含 ＳａｌＩ酶切位点，应用引物对几种不同的伪狂犬病毒株多聚酶链式反应扩增结果全为阳性。     

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

猪伪狂犬病抗体免疫金标快速检测试纸法

应用免疫学原理与胶体金层析技术相结合，采用双抗原夹心法建立了检测猪伪狂犬病抗体水平的“猪伪狂犬病抗体免疫胶体金快速检测试纸法”，用该法与美国Idexx公司的猪伪狂犬病ELISA试剂盒，同时对16纷猪血液或血清进行抗体水平检测，符合率达100％。同时使用金标法对100份猪血液和对应血清进行检测，结果也相同。试验结果显示．金标法与ELISA一样，具有微量、特异、准确等优点，且操作简易，而金标法不需要任何仪器，检测时间短．结果直观，容易判定，适用于基层兽医站、养猪场使用和大面积猪伪狂犬病抗体普查。     

猪伪狂犬病基因缺失疫苗的制备、安全性、免疫原性、保存期测定及区域试验

为了提供有效的伪狂犬病疫苗，用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB-98突变株（TK^-/gG^-/LacZ^＋），研制了伪狂犬病基因缺失疫苗，并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定，同时也对4批疫苗的安全性、效力、免疫期和保存期进行了检测；同时将4批疫苗用于免疫23个猪场的母猪、新生仔猪和育肥猪进行区域试验。测定结果表明，疫苗经上述两种途径接种对不同阶段猪的最小免疫剂量均为10^5.0 TCID50；10倍免疫剂量的疫苗对初生仔猪、15日龄仔猪和妊娠母猪是安全的，免疫猪能抵抗强毒的攻击；疫苗在4℃和-20℃下分别可保存6个月和12个月。对伪狂犬病毒抗体阴性的70日龄商品猪和种猪的免疫期为6个月。田间试验表明，4批猪伪狂犬病基因缺失疫苗安全有效，并可用于仔猪发病时的紧急接种。为猪伪狂犬病基因工程疫苗的制备与应用提供了有力的依据。     

Ethyl acetate fraction of flavonoids from Polygonum hydropiper L. modulates pseudorabies virus-induced inflammation in RAW264.7 cells via the nuclear factor-kappa B and mitogen-activated protein kinase pathways

Pseudorabies virus (PRV) infection leads to severe inflammatory responses and tissue damage, and many natural herbs exhibit protective effects against viral infection by modulating the inflammatory response. An ethyl acetate fraction of flavonoids from Polygonum hydropiper L. (FEA) was prepared through ethanol extraction and ethyl acetate fractional extraction. An inflammatory model was established in RAW264.7 cells with PRV infection to evaluate the anti-inflammatory activity of FEA by measuring cell viability, nitric oxide (NO) production, reactive oxygen species (ROS) release, and mRNA expression of inflammatory factors, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase-2 (COX-2). Its functional mechanism was investigated by analyzing the phosphorylation and nuclear translocation of key proteins in the nuclear factor-kappa B (NF-κB) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. Our findings indicate that PRV induced inflammatory responses in RAW264.7 cells, and the responses were similar to that in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated cells. FEA significantly suppressed NO synthesis and down-regulated both expression and secretion of COX-2, iNOS, and inflammatory cytokines (P<0.05 or P<0.01). FEA also reduced NF-κB p65 translocation into the nucleus and decreased MAPK phosphorylation, indicating that the NF-κB/MAPK signaling pathway may be closely related to the inflammatory response during viral infection. The findings suggested the potential pharmaceutical application of FEA as a natural product that can treat viral infections due to its ability to mitigate inflammatory responses.     

Pseudorabies virus infection in hunting dogs in Oita,Japan: Report from a prefecture free from Aujeszky’s disease in domestic pigs

We isolated two pseudorabies virus (PRV) isolates (designated OT-1 and OT-2) from two hunting dogs exhibiting neurological manifestations after eating the flesh of wild boar hunted in Oita prefecture, Kyushu Island, Japan. The isolates corresponded to a previously reported PRV (MY-1 strain) isolated from a hunting dog in neighboring Miyazaki prefecture, and it clustered into genotype II based on the glycoprotein C sequence. Our results suggest that this common PRV strain may have been maintained in wild boars on Kyushu Island even though domestic pigs in this area have attained an Aujeszky’s disease-free status.     

山东省菏泽市某规模猪场不同猪群伪狂犬病野毒感染情况调查

为了解规模猪场不同猪群的伪狂犬病病毒(PRV)感染情况及场区病毒载量分布特点,在山东省菏泽市某规模猪场,利用实时荧光定量PCR方法,对该猪场不同孕龄母猪、不同阶段生长猪群,以及各生产阶段场区环境,采集猪鼻拭子和场区环境拭子进行PRV-gE核酸检测,并对检测结果进行统计分析。结果显示:在294份猪鼻拭子中,检出42份PRV-gE核酸阳性,总阳性率为14.28%;母猪群PRV-gE阳性率为17.83%(23/129),且妊娠前后各阶段阳性率呈先上升后下降趋势,中期较高(24.00%),但差异不明显(P>0.05);不同阶段生长猪群的平均PRV-gE阳性率为11.52%(19/165),随日龄增加,阳性率也呈先上升后下降趋势,80~90日龄育肥猪最高(28.13%),与其他生长阶段猪群差异明显(P<0.05);除饲料、水源、上猪台和出猪台外,其他大部分场区环境均检测到PRV-gE核酸阳性;育肥猪群病毒载量最高,为3.6×105拷贝数/mL,其猪舍环境的病毒载量也较高,与其他环境及生长阶段猪群差异均明显(P<0.05)。结果表明,不同猪群包括免疫猪群均可遭受PRV野毒感染,尤其是母猪妊娠中期和猪育肥阶段早期,且大部分场区环境均可被污染。结果提示,规模猪场要加强各种猪群尤其是育肥猪群的伪狂犬病免疫,通过监测来调整和优化免疫程序,同时要加强生物安全,防止病毒传入和扩散。     

猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗的制备及安全性与免疫性试验

用本室分离鉴定的猪伪狂犬病毒鄂A经毒株接种仓鼠肾细胞（BHK－21）,制备病毒抗原液，毒价不低于10^-6TCID50/0.1ml。经一定浓度的甲醛溶液灭活后与油相佐剂乳化研制成油乳剂灭活油疫苗4批。本研究对该制品的安全性、免疫性进行了测定。对18g左右小白鼠接种0.3ml，初生仔猪、断奶仔猪及妊娠母猪加倍剂量注射，均未出现不良反应，安全性良好。对母猪的繁殖性能不产生影响。后备母猪及妊娠母清中和抗体指数于免疫后21d达到316以上，间隔35d加强免疫一次后，中和抗体指数可达1000以上。断奶仔猪及初生仔猪免疫后对强毒的攻击，保护率分别为100％及90.62％。     

广东部分地区中小型猪场猪伪狂犬病野毒感染的血清学调查

采用阻断ELISA法,对广东省9个地区经猪伪狂犬基因缺失苗免疫的中小型猪场2005年-2006上半年送检的375份血清进行猪伪狂犬病野毒感染的血清学检测。结果表明,有9个地区猪场血清呈阳性,其中阳性血清174份,平均阳性率为46.4%,最高阳性率达65.0%,提示该地区中小型猪场有猪伪狂犬病野毒感染。     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。