坛紫菜耐高温品系的选育与海区中试

利用人工诱变和体细胞再生技术,选育出可在30℃下生长的坛紫菜耐高温品(Q-1),实验结果表明:(1)在高温(28℃和30℃)下培养15d,Q-1品系的壳孢子成活率分别为76.8%和60.1%,分裂率分别为100%和83%;而对照组野生型(WT)品系的壳孢子成活率分别为15.9%和6.7%,分裂率分别为90.4%和63.8%。Q-1品系的壳孢子成活率和分裂率均远高于WT品系。(2)在常温(24℃)下培养35d的Q-1和WT品系壳孢子苗,在24℃、28℃和30℃组中再分别培养25d,Q-1品系的苗平均体长分别增加了19.4、10.8和2.8倍,而WT品系的苗平均体长分别只增加了7.3、1.7和0.9倍;Q-1品系的苗平均体长分别为WT品系的2.5、5.8和1.9倍。另外,在28℃和30℃中培养15d的WT品系幼苗发生了大面积腐烂;而Q-1品系幼苗没有出现任何烂苗迹象,表现出较好的生长。Q-1品系在海区中试中也表现出很好的耐高温特性。2008年秋季,坛紫菜采苗后遇到了长时间的高温天气,当地传统养殖的坛紫菜野生种发生了大规模腐烂与脱苗,产量大幅度减少;而Q-1品系的苗仍然维持良好的生长势头,没有出现烂苗,取得了高产。由此证实,Q-1品系是既能较快生长又耐高温的品系,有很大的生产应用价值。     

坛紫菜杂交品系优势的初步评价

通过坛紫菜诱变选育品系和野生选育品系间杂交,筛选出了4个经济性状优良的杂交品系(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ);杂交品系的子代表现出较大的杂交优势,既具有亲本优势,又具有超亲优势;品系Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的3～5cm幼苗经过10d培育,平均日增重量的超标优势分别达12.35%、139.78%、107.57%和173.52%;杂种优势指数达99.83%、213.07%、184.44%和243.05%;品系Ⅱ耐高温能力较强,在29℃水温中可正常生存10d以上;品系Ⅲ在4个杂交品系中生长最快,培育20d时藻体的平均长度是父本的1.29倍,总藻胆蛋白含量最高,达(103.83±0.49)mg/g干品;品系Ⅳ和Ⅴ藻体宽而薄,不易腐烂和老化,其中品系Ⅳ叶绿素含量高达(9.79±0.48)mg/g干品,比母本高46.21;从杂交品系的性状稳定性来看,品系Ⅱ的F2和F3叶状体长度生长相对稳定,品系Ⅲ的F3叶状体经过选育后,生长性能比F2叶状体更加突出。和F2叶状体相比,品系Ⅳ的F3各项指标表现出较大的稳定性。本研究为坛紫菜杂交育种的应用积累了有用资料。     

坛紫菜自由丝状体对无机碳的利用

Free-living Porphyra haitanensis conchocelis was cultured under continual light,then it was treated with Van,DIDS and SITS,the inhibitors of inorganic carbon utilization,to study the mechanism of inorganic carbon utilization in the conchocelis.The results indicate that Van inhibits the utilization of inorganic carbon most,with a rate of 71.3%,and the rates of DIDS and SITS are relatively lower,42% and 35.5% respectively.The inhibition rate of Az is 25.3%,which indicates the external CA is not an important part of its inorganic carbon uptake.A complementary conclusion is that the main part of inorganic carbon absorption in P.haitanensis conchocelis is through active transport of HCO3^- and CO2.     

海水围塘生态栽培坛紫菜

紫菜（Porphym sp）原是生长在潮间带的岩礁上，尤其是在风浪大、潮流畅通的海区生长良好。经过多年的人工栽培，紫菜已适应于在潮间带和浅海的养殖筏架的栽培。坛紫菜（Porphyra haitanensis）作为浙江、福建海区常见的栽培藻类和重要的食用经济海藻，有近40年栽培的历史。但潮间带可以用作栽培坛紫菜的空间越来越小，必须开拓新的栽培空间。在围塘栽培紫菜则是一种新开拓的栽培方法。     

基于液质联用技术的坛紫菜甘油-3-磷酸胁迫响应分析

甘油-3-磷酸作为渗透压调节物红藻糖苷的合成前体物,参与藻类抗逆应答过程。为了解坛紫菜的抗逆机制,通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)建立甘油-3-磷酸的定量分析方法,分析非生物(温度、盐度和干出)胁迫下的甘油-3-磷酸响应规律。结果表明,温度胁迫1 h后,甘油-3-磷酸的含量快速变化,当温度高于23℃时,甘油-3-磷酸含量与胁迫温度成正比,而在12℃低温下,甘油-3-磷酸的含量反而下降;盐度胁迫促使甘油-3-磷酸的含量快速上升,且高盐胁迫下的变化显著高于低盐环境;而短时间1 h干出胁迫后的甘油-3-磷酸含量略有上升(1.19倍,与对照组相比),但随着干出时间继续延长,甘油-3-磷酸含量总体呈现下降趋势。温度、盐度和干出胁迫后的坛紫菜进行恢复培养后,甘油-3-磷酸含量均趋于对照组水平。综上可知,甘油-3-磷酸可快速响应环境胁迫,这为坛紫菜红藻糖苷抗逆机制的多层次研究奠定了基础。     

琼胶寡糖激发坛紫菜对附生细菌的减少作用

以琼胶寡糖处理坛紫菜Porphyra haitanensis,激发其防御反应,坛紫菜在18℃生长和35℃热激时的病烂现象得到明显改善。寡糖激发的防御信号能够杀死附生在藻上的细菌,健康藻上约94.7%的附生菌群在加入100μg.mL-1琼胶寡糖1 h内被杀死,但过氧化氢酶可部分抑制这种作用。利用3种抗生素组合获得无菌坛紫菜体系,回染致病细菌后,约60.8%的回染细菌在寡糖激发后的3 h内被消灭。这种附生细菌的减少现象不是源于琼胶寡糖的直接抑菌作用,可能与琼胶寡糖引起坛紫菜H2O2的瞬时暴发有关。结果表明,琼胶寡糖能够作为坛紫菜的抗性激发子,通过诱导坛紫菜自身的防御反应来减少附生细菌的数量,从而保持藻体的健康生长。     

高温胁迫下坛紫菜中红藻糖苷及其异构体的含量变化

为了解热激应答下坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的变化,以及两者与坛紫菜高温耐受性之间的联系,以ME-05坛紫菜为样品,采用高效液相色谱三重四级杆质谱联用技术(HPLC-MS)分析35℃高温胁迫和20℃恢复培养条件下,坛紫菜中红藻糖苷及其异构体含量的变化趋势,通过两者的含量波动,探讨其与坛紫菜耐受性之间的关系。结果表明,相同品种、相同日龄但生长地点不同的坛紫菜中,红藻糖苷含量稳定;不同生长阶段的坛紫菜经35℃高温胁迫后,红藻糖苷和异红藻糖苷含量减少,经恢复培养3 h后发现红藻糖苷和异红藻糖苷含量逐渐回升并超过对照组;红藻糖苷和异红藻糖苷的变化率为:Ⅲ组(生长期第75天)>Ⅳ组(生长期第135天)>Ⅱ组(生长期第45天)>Ⅰ组(丝状体),红藻糖苷的变化更为敏感且具有规律。综上,红藻糖苷与坛紫菜的生长状况和抗逆能力相关,可作为紫菜选育的指标物。本研究结果为进一步探讨坛紫菜在高温胁迫下的生理响应及健康养殖奠定了理论基础。     

坛紫菜优质新品系（Q-1）主要经济性状的研究

对杂交选育的坛紫菜优质品系（Q-1）和人工养殖的坛紫菜（对照组）进行叶状体生长、藻体厚度、4种色素含量、粗蛋白、氨基酸含量的测定以及丝状体的生长发育等实验。结果表明,（1）（Q-1）F2、F3叶状体生长迅速,不易成熟;3～4cm的F。叶状体经过10～15d的培养,平均日增长量高达（8．33±1．01）cm,分别为父、母本的1．4和2．7倍;（2）F3叶状体在第1次剪收时藻体厚度为（21．0±1.5）μm,仅为对照组厚度的52％,第2次剪收时为（25．6±1．9）μm,为对照组的56％;F2剪收1次后藻体的长度、宽度和鲜重平均日增长量分别为对照组的2．1、2．4和2．2倍;（3）F2叶状体的总藻胆蛋白含量为（109．52±0．94）mg／g,为对照组的1．6倍;粗蛋白的含量高达（41．71±．11）g／100g,比对照组高27％;F。叶状体第1次剪收时叶绿素a的含量高达（7．66±0．19）mg／g,比对照组高13％;（4）F3叶状体第1次剪收时呈味氨基酸中鲜味氨基酸与甜味氨基酸的总量为2．49g／100g,为对照组的1．8倍;必需氨基酸含量为15．66g／100g,比对照组高13％;（5）（Q-1）和对照组的丝状体在29℃分别培养30～40d时,90％的营养藻丝发育成孢子囊枝。     

3种植物生长调节剂对坛紫菜自由丝状体生长与光合色素含量的影响

采用单因素分析法,比较研究了添加3种外源植物生长调节剂(吲哚乙酸IAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、激动素KT)对野生型坛紫菜(Pyropia haitanensis)自由丝状体生长及光合色素含量的影响。结果表明:与对照组相比,低浓度的IAA(0.5~4.0 mg·L~(-1))和KT(0.5~2.0 mg·L~(-1))对藻体的特定生长率有显著影响,以2.0 mg·L~(-1)IAA和1.0 mg·L~(-1)KT对藻体的促生长效应最大,培养25 d时藻体鲜重增加最大,分别是对照组的1.90倍和1.52倍(P0.05)。高浓度的IAA(6.0~10.0 mg·L~(-1))和KT(4.0~10.0 mg·L~(-1))却会抑制藻体生长(P0.05)。培养25 d时,与对照组相比,2.0 mg·L~(-1)IAA和1.0 mg·L~(-1)KT均有利于叶绿素a(Chl a)和类胡萝卜素(Car)的合成,Chl a含量分别增加了23.7%和23.8%;Car含量分别增加了31.0%和28.6%(P0.05)。然而,高浓度的IAA和KT(6.0、10.0 mg·L~(-1))不利于Chl a的合成,其处理浓度越高,Chl a含量下降越多。与对照组相比,较低浓度的IAA(1.0~2.0 mg·L~(-1))明显促进藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)合成,其中2.0 mg·L~(-1)IAA处理组PE、PC含量最高,分别增加了59.1%和45.7%(P0.05)。较低浓度的KT(0.5~2.0 mg·L~(-1))均有利于PE、PC合成,其中0.5 mg·L~(-1)KT处理组的PE、PC含量增加最多,分别提高了48.4%和50.5%(P0.05)。高浓度的IAA(6.0、10.0 mg·L~(-1))和KT(10.0 mg·L~(-1))则明显降低了PE、PC合成(P0.05)。2,4-D对藻体的特定生长率和光合色素合成无显著影响(P0.05)。     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。