Effects of different NS genes of avian influenza viruses and amino acid changes on pathogenicity of recombinant A/Puerto Rico/8/34 viruses

To examine the effects of the NS1 and NEP genes of avian influenza viruses (AIVs) on pathogenicity in mice, we generated recombinant PR8 viruses containing 3 different NS genes of AIVs. In contrast to the reverse genetics-generated PR8 (rPR8) strain and other recombinant viruses, the recombinant virus rPR8-NS(0028), which contained the NS gene of A/chicken/KBNP-0028/2000 (H9N2) (0028), was non-pathogenic to mice. The novel single mutations of 0028 NS1 to corresponding amino acid of PR8 NS1, G139D and S151T increased the pathogenicity of rPR8-NS(0028). The replacement of the PL motifs (EPEV or RSEV) of pathogenic recombinant viruses with that of 0028 (GSEV) did not reduce the pathogenicity of the viruses. However, a recombinant virus with an EPEV-grafted 0028 NS gene was more pathogenic than rPR8-NS(0028) but less than rPR8. The lower pathogenicity of rPR8-NS(0028) might be associated with the lower virus titer and IFN-β level in the lungs of infected mice, and be attributed to G139, S151 and GSEV-PL motif of NS1 gene of 0028. In conclusion we defined new amino acid residues of NS1 related to mice pathogenicity and the presence of pathogenic NS genes among low pathogenic AIVs may encourage continuous monitoring of their mammalian pathogenicity.     

猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。     

3D-MOTIF Method and Its Application to Microscale Topography

The 2D motif method is a surface characterization method promising to separate roughness and waviness from a profile and is adopted by ISO,so is meaningful to extend this method to 3D.Vincent's watershed algorithm is employed for the generation of 3D-motif.A smallest area selecting criteria is proposed for the use of clearing the small motifs which are concerned as noise.As there are no manipulating factors as 2D-method,a multi-scale analysis is employed based on area and depth criteria,the use of depth criteria is to prevent the combination of two adjacent motifs if there is a significant peak on the border of them.Finally the surface of C(100) are analyzed by the presented method,the texture of this surface has been characterized.     

鸡败血支原体pMGA多基因家族及其免疫逸机制的研究进展

pMGA多基因家族主要编码一类黏附素／血凝素蛋白，存在于鸡败血支原体的细胞表面，其主要功能是促进支原体黏附到宿主细胞上。近年来的相关研究发现，编码pMGA的基因数量从32－70不等，主要转录水平上通过（GAA）n 基序的数量改变引发pMGA基因的选择性转录，造成pMGA的抗原发生变异，从而干扰宿主正常免疫功能的发挥，使支原体对宿主产生严重的免疫逃逸。其中，（GAA）n基序已被证实在pMGA基因表达调控中起重要作用，这一三联体重复基序数目的多少直接影响到pMGA基因的ON／OFF不，本文通过对鸡败血支原体pMGA多基因家分子生物学研究进展浅要综述，以提出pMGA基因可能的转录调控机制，这对研究鸡败血支原体的分子致病机理及其免疫机制大有裨益。     

P0 protein of cotton leafroll dwarf virus-atypical isolate is a weak RNA silencing suppressor and the avirulence determinant that breaks the cotton Cbd gene-based resistance

Cotton blue disease (CBD) is the most important disease present in cotton crops in South America and cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) is the causal agent. The disease has been controlled by sowing cotton varieties resistant to CLRDV. However, in the 2009/10 growing season, an outbreak due to an atypical CLRDV isolate (CLRDV-at) occurred in northwest Argentina. Although CLRDV and CLRDV-at genomes are very closely related, the symptoms they produce in cotton plants are quite different. P0 is the most divergent protein between the isolates and in CLRDV is a silencing suppressor protein. This work characterized the silencing suppressor activity of the P0 protein encoded by CLRDV-at (P0^CL-at) and evaluated its role in Cbd-resistance break in cotton plants. It was demonstrated that P0^CL-at, despite having a mutation in the consensus of the F-box-like motif, was able to suppress local RNA silencing, but displayed lower activity than P0^CL. P0^CL and P0^CL-at showed no differences in the interaction with Gossypium hirsutum SKP1 orthologue (GSK1) and Nicotiana benthamiana SKP1 and both P0 proteins triggered destabilization of ARGONAUTE1. However, when the ability to enhance PVX symptoms was evaluated, P0^CL-at was shown to be a weaker pathogenicity factor than P0^CL in N. benthamiana. Interestingly, trans-expressed P0^CL-at enabled CLRDV to systemically infect CBD-resistant plants, and a chimeric CLRDV-P0^CL-at infectious clone succeeded in establishing infection in CBD-resistant cotton varieties with symptoms resembling those produced by CLRDV-at. These results strongly suggest that P0^CL-at is the avirulence (Avr) determinant involved in breaking cotton Cbd gene-based resistance.     

大弹涂鱼白细胞介素-8基因分子进化及不同病原体刺激对其表达的影响

实验从大弹涂鱼皮肤组织转录组中筛选出大弹涂鱼IL-8基因,并分析了其序列特征,构建了系统发生树,评估了IL-8基因在健康个体不同组织中的表达差异,以及在不同病原体刺激下IL-8基因在机体主要免疫器官肝脏和脾脏中的表达情况。结果显示,该基因的开放阅读框由306个碱基组成,编码101个氨基酸残基,包含典型的由18个氨基酸残基组成的信号肽,和1个由62个氨基酸残基组成的SCY结构域,该结构域还包含了4个保守的半胱氨酸残基,分别为Cys-30、Cys-32、Cys-57和Cys-73。大弹涂鱼IL-8氨基酸序列中的受体结合位点基序ELR (Glu-Leu-Arg)被Asn-Ser-His (NSH)取代,系统进化分析表明,纯化选择影响了鱼类该基序的多样性,且IL-8基因在大弹涂鱼乃至硬骨鱼中不可取代。荧光定量实验结果显示,IL-8基因在大弹涂鱼的健康组织中广泛表达,在鳃和脑中表达量最高。细菌和poly(I∶C)注射实验表明,在受到感染后,肝、脾和脑组织中IL-8的表达量均上调,说明IL-8基因在大弹涂鱼肝、脾和脑组织的炎性反应和免疫应答中起到了重要作用,为大弹涂鱼免疫基因的后续研究提供了参考。     

CpG-DNA的功能及应用前景

在细菌及病毒的 DNA中普遍存在的以及人工合成的非甲基化的 Cp G基序能通过 Toll样受体 9能直接活化 B细胞 ,诱导其增殖并抑制其凋亡 ;能促进免疫球蛋白和 IL -6、IL -1 0以及 IL -1 2等细胞因子分泌 ;增加 MHCII类分子和 B7共刺激分子的表达 ;激活单核巨噬细胞及树突状细胞分泌各种 Th1型细胞因子和趋化因子 ;促进淋巴细胞增殖 ,诱发体液和细胞介导的免疫反应。Cp G-DNA还可以间接活化细胞毒性T细胞 ,促进 Ig G2 a及 Ig M的优势表达 ,从而转换免疫反应的类型 (Th 到 Th ) ,因此 Cp G-DNA作为一类有希望的免疫增强剂在增强疫苗免疫效果和抗感染免疫中都有潜在的应用前景。     

绵羊Myostatin基因5′调控区的生物信息学分析及孕激素对调控区活性的影响

【目的】克隆并分析绵羊Myostatin基因5′调控区,并在细胞水平研究孕激素对该调控区活性的影响。【方法】利用PCR方法扩增绵羊Myostatin基因5′调控区,采用MatInspector等软件分析并比较其和牛、猪调控区的调控元件和转录因子。以EGFP为报告基因,构建表达载体,转染C2C12细胞,同时添加不同剂量的孕激素（0、10、100和1 000 nmol•L-1）,然后通过RT-PCR方法检测报告基因EGFP和内源性Myostatin的mRNA水平。【结果】获得绵羊约3.2 kb Myostatin基因5′调控区（MSTN5′regu）,预测了两个对双肌性状可能存在贡献的位点。在绵羊、牛和猪的相应调控区发现了许多可能对该基因转录调控起重要作用的调控元件和相应转录因子,包括E-box、MEF2、MTATA、MTBF、HOMF、PRE、ARE和GRE等。各种元件在不同动物间基本都有,但具体的序列、位置以及数量有所差异。成功构建了绵羊pMSTN5′regu-EGFP表达载体,且转染后100 nmol•L-1孕激素明显抑制了内源性Myostatin mRNA和报告基因EGFP mRNA的表达。【结论】绵羊Myostatin基因的转录受多种转录因子和相应调控元件的调控,适量孕激素可通过下调Myostatin基因5′调控区的活性而抑制该基因的转录。     

兰州熊蜂气味受体家族鉴定及分析

【目的】了解兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)基因组中气味受体基因(odorant receptors,Ors)情况,为进一步分析气味受体功能提供信息,从而为研究该基因家族在熊蜂觅食、交尾、通讯等行为中的重要功能打下基础。【方法】提取兰州熊蜂胸部基因组DNA,进行Illumina高通量测序,对测序所得原始序列进行质控并拼接获得基因组序列,然后使用本地blast 2.2.28+对构建兰州熊蜂基因组本地数据库,使用已知的地熊蜂(Bombus terrestris)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)的气味受体蛋白序列作为种子序列搜索数据库获得兰州熊蜂的气味受体序列;使用EMBOSS1.5对气味受体蛋白序列进行基本理化分析,利用GSDS2.0对家族序列的内含子与外显子位置进行分析,然后使用MEME 4.11.2对氨基酸序列进行保守基序分析,最后利用Clusta W 2.1、Trim Al 1.2、Phy ML3.0对兰州熊蜂、地熊蜂和意大利蜜蜂气味受体家族序列进行系统进化分析。【结果】共获得165个兰州熊蜂气味受体基因,包括1个非典型气味受体(olfactory receptor co-receptor,Orco)、5个假基因和159个气味受体。基因结构分析发现,气味受体家族外显子数目从4个到9个不等。其中Or 47—57的序列中外显子数量最少,为4个;Or 128—161中外显子的数量最多,为9个。根据基因结构的不同,将气味受体分为10大类型,每个类型中的序列都有相似的外显子长度与数量。Or 1—38、Or 69—85、Or 128—164这3大类所包含成员数较多(分别为38、17、37),其他7类包含成员个数都约10个,且每个类型中序列在染色体上都呈串联排布,其中Or 1—38中都包含一个较长的第一外显子。保守基序分析发现,在检索的10个保守基序中,除基序5为未知基序外,其他9个基序均包含在其保守结构域(7tm_6 domain)中。Or1—38与Or 39—46多数成员包含全部10个保守基序,基序2、3、4、9广泛存在于该家族成员序列中,这4个基序可能为该家族关键的功能区域。系统发育分析将Ors分为5个亚家族(I—V),其中亚家族II包含2种基因结构类型序列(Bl Or 97—100与Bl Or 69—85),亚家族V包含4种(Bl Or 1—46、47—57、86—95和101—107)。Bl Or 150—155与Am Or 122—139分别聚为两个分支,Bl Or 47—57与Am Or 63—65也发现类似的聚类,这表明在进化中,蜜蜂与熊蜂的Ors出现了特异性的扩张与缺失。在进化树中发现Or 115较早与其他成员分离,位于树的基部,推测该序列可能更接近气味受体家族的祖先序列。【结论】探明了兰州熊蜂的Or基因数量、基因结构及其进化关系;该基因家族在进化过程中部分成员保守基序丢失,这些结果为进一步了解Or基因功能打下了基础。