信阳地区猪弓形虫病分子生物学鉴定及基因型分析研究

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测;随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定,建立猪弓形虫病特异PCR诊断方法。并采用多基因位点PCR-RFLP方法对信阳地区猪源弓形虫分离株进行基因型鉴定,结果表明,信阳市猪弓形虫分离株均为基因型Toxo DB#9,该型也是流行于我国的弓形虫优势基因型。     

弓形虫上海株SAG2基因克隆和序列分析

目的:对弓形虫上海株SAG2基因进行克隆与鉴定。方法:采用PCR方法从弓形虫上海株总DNA中扩增到SAG2基因,与pGEM-T-easy vector连接,并进行DNA测序分析。结果:用DNAStar软件对扩增出的片断与GenBank上的7个虫株相应的序列进行同源性比较,不同宿主和不同区域上的弓形虫SAG2基因序列差异很小。结论:用基因重组技术获得的SAG2抗原,作为候选疫苗和诊断抗原,有着广阔的发展前景。     

南江黄羊脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因多态性与生长性状关联分析

根据山羊A-FABP mRNA序列设计2对引物扩增南江黄羊A-FABP基因部分外显子3、内含子3和外显子4序列,利用克隆测序的方法寻找南江黄羊A-FABP基因的多态性,采用PCR-RFLP的方法进行多态性检测并与生长性状进行关联性分析。结果显示,在南江黄羊A-FABP基因第3内含子和第4外显子序列上分别发现T143C和T546C2个点突变位点,其中T546C位点为同义突变,这2处突变各自产生3种基因型CC、TC和CC,χ2检验显示,这2个位点均处于中度多态且在南江黄羊群体中分布处于Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）。关联分析显示,T143C位点TC基因型公羊个体的成年胸围显著长于TT型（P〈0.05）;T546C位点CC基因型公羊个体的周岁体长显著长于TT基因型（P〈0.05）,TC基因型母羊个体的6月龄体质量和胸围均显著长于CC基因型（P〈0.05）,其余生长性状在不同基因型个体间差异不显著（P〉0.05）。结果表明：南江黄羊A-FABP基因第3内含子和第4外显子多态性可能对个体生长性状产生一定的影响。     

东佛里生羊MSTN基因多态性及其与生长性状的关联分析

试验旨在研究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因多态性及其对东佛里生羊生长性状的影响。从324只东佛里生羊全血中提取DNA,对MSTN基因外显子序列和非翻译区(untranslated region,UTR)序列进行PCR扩增,采用一代测序技术鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,分析不同位点的遗传多态性,并将不同基因型与东佛里生羊的生长性状进行关联分析。结果显示,在东佛里生羊MSTN基因外显子中未检测到突变;在3'-UTR区的272 bp处存在G→A单碱基突变,该位点只检测到AG和AA基因型,且AA基因型频率高于AG基因型;在5'-UTR区的176 bp处存在C→A突变,该位点只检测到CC和AC基因型,且CC基因型频率高于AC基因型。遗传多样性参数分析结果表明,东佛里生羊群体MSTN基因3'-UTR-272和5'-UTR-176位点的纯合度分别为0.827和0.887,杂合度分别为0.173和0.113,2个位点的多态性均较低(PIC<0.25),其群体基因型分布均符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)。关联分析发现,3'-UTR-272位点AG基因型体斜长显著高于AA基因型(P<0.05),5'-UTR-176位点CC基因型胸围显著高于AC基因型(P<0.05),其余指标均无显著差异(P>0.05)。综上,东佛里生羊MSTN基因3'-UTR和5'-UTR突变位点可作为其目标性状选育的分子标记。     

3株不同宿主源弓形虫分离株GRA7基因的克隆与序列分析

对分离于江苏地域的3株不同宿主源弓形虫YZ-1(ChineseⅠ基因型)、YZ-2(ChineseⅠ基因型)和KS(基因型Ⅰ型)分离株的GRA7基因的全长序列进行克隆与序列分析,结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明:KS株的GRA7基因完整开放阅读框长711 bp,与RH参考株完全一致;YZ-1和YZ-2株GRA7基因序列均为708 bp,与KS株相比在290-292位点缺失3个碱基;氨基酸序列和抗原表位分析显示,YZ-1和YZ-2株的GRA7蛋白在97位缺失1个谷氨酸,但比KS和RH株多1个抗原表位。结果表明,GRA7基因可区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型虫株,ChineseⅠ型与Ⅱ型虫株的亲缘关系最近;ChineseⅠ型GRA7基因在290-292位点缺少3个碱基,其GRA7蛋白多1个抗原表位。     

刚地弓形虫GRA25基因的克隆及序列分析

本研究旨在对来源于不同宿主和地理分布的22株弓形虫的GRA25基因进行PCR扩增并测序,对获得的GRA25基因序列进行比对,利用MP和ML两种方法对不同分离株的GRA25基因构建系统进化树。利用生物信息学软件将弓形虫RH株的GRA25基因翻译成氨基酸序列,对其编码蛋白的生物学特征进行分析。结果显示,弓形虫GRA25基因序列有2种长度,分别为939和948 bp。序列比对结果显示,GRA25基因在不同虫株间有82个核苷酸变异位点,变异率为0~4.4%。进化分析结果显示,用GRA25基因不能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型虫株。生物信息学分析预测弓形虫GRA25蛋白含有7个亲水区域,10个α-螺旋,3个β-折叠,8个无规则卷曲和8个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。本研究结果表明,GRA25基因不能作为标记分子区分不同基因型的弓形虫虫株,但可能作为疫苗候选分子研制新型抗弓形虫基因疫苗或表位肽疫苗。     

鸭A-FABP基因内含子1多态性与肌内脂肪和血清甘油三酯含量相关研究

本研究旨在探讨鸭脂肪型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte Fatty Acid-Binding Protein,A-FABP)基因部分序列多态与鸭肌内脂肪和血清甘油三酯含量关系。根据鸭A-FABPmRNA序列和鸡A-FABP基因组序列设计1对引物扩增鸭A-FABP基因内含子1序列。同时根据扩增产物设计4对引物,利用PCR-SSCP对鸭A-FABP基因部分序列进行多态性研究并探究序列多态性与鸭肌内脂肪和血清甘油三酯含量的关系。结果表明:克隆序列包含鸭A-FABP基因外显子1、2部分序列和完整的内含子1序列,与鸡A-FABP基因内含子1同源性为75.1%;经SS-CP检测,发现引物P1扩增片段有3处碱基突变,引物P3有6处碱基突变,这些突变分别产生了3种和8种基因型。在P1位点樱桃谷鸭和苏牧麻鸭偏离了Hardy-Weinberg平衡(P0.01),金定鸭基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),在P3位点3个群体均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。同时,这些基因型在不同群体中分布存在显著或极显著差异(P0.05或P0.01)。最小二乘分析显示,肌内脂肪和血清甘油三酯含量在各群体中有显著差异(P0.05),P1和P3位点各基因型对肌内脂肪含量无显著影响(P0.05),仅在P3位点CD基因型个体血清甘油三酯含量显著高于其他基因型个体(P0.05)。结果提示,鸭A-FABP基因内含子1多态对血清甘油三酯含量有一定影响,但是否影响鸭肌内脂肪沉积,还需进一步研究。     

奶山羊弓形虫ITS1和529bp基因序列分析

采集关中某羊场奶山羊的血液样品,以提取的血液基因组DNA为模板对弓形虫ITS1及529bp基因进行PCR扩增、测序,并对测序结果进行比对,基于529bp重复序列构建系统进化树。序列分析结果表明,待测样品与GenBank中弓形虫RH虫株的ITS1序列(AY259044)完全一致,与529bp重复序列(FJ656209.1)存在差异;基于529bp重复序列构建的系统进化树分析结果显示,待测样品弓形虫与RH虫株遗传距离最近。该结果为奶山羊弓形虫病的分子流行病学、诊断方法的建立等方面的研究奠定了基础。     

云南省家禽弓形虫感染的流行病学调查及基因分型研究

为了解云南省家禽中弓形虫感染的流行情况,于2018年3月至2020年12月,在云南省家禽养殖比较集中的地区,从8个规模化家禽养殖场、10个地方鸡养殖场及部分散养户中采集各种家禽血样及土壤样品2 802份,采用间接血凝试验(IHA)和套式PCR方法对弓形虫的抗体和核酸分别进行检测,并对核酸检测为阳性的样品通过PCR-RFLP进行了基因分型研究。结果显示:云南省家禽中弓形虫平均抗体阳性率为4.48%,血样、土壤核酸的平均阳性率分别为1.40%和2.74%;不同饲养模式、不同品种、不同地区之间存在一定差异,但地方品种家禽和散养家禽阳性率明显高于规模化养殖场;云南省家禽感染的弓形虫及环境中弓形虫的基因型主要是Ⅰ型,占表面抗原SAG3基因分型的97.92%(47/48)。提示:应重视地方品种家禽和散养家禽中弓形虫病的流行控制,加强饲养管理并采取综合防控措施。     

肉牛PRKAG3基因多态性及其与胴体和肉质性状的关联分析

本研究以晋南牛、鲁西牛、西门塔尔、安格斯、海福特、利木赞和夏洛莱7个品种共267头肉牛为试验材料,采用PCR-RFLP技术检测PRKAG3基因多态性,找到了PRKAG3基因DNA序列中的2个突变位点T2643C和T2885C(DQ082736),同属第4内含子.2个基因多态性位点与肉牛胴体和肉质共9个性状的关联分析表明:PRKAG3基因T2885C变异位点的3个基因型间嫩度性状差异显著(P<0.05),CC基因型最dx-乘均值显著低于CD和DD基因型最dx-乘均值.本研究结果可为肉牛肉质性状标记辅助选择提供依据.     

一种诊断猪弓形虫病的新方法——碘标对流免疫电泳法

作者报导用碘标记弓形虫病小鼠腹腔液分泌抗原对流免疫电泳新方法（ＲＣＩＥＰ）直接检测受检猪特异性抗体。ＲＣＩＥＰ与常规间接血凝（ＩＨＡ）对５０例病猪血清和５０例健康猪血清进行对比试验，结果证实该法具有高度的敏感性、特异性和较好的重现性。在不同稀释度时，弓形虫病猪血清ＲＣＩＥＰ和ＩＨＡ的阳性率分别为９４～１００％（平均９８．８０％）和２２～１００％（平均５８．８０％），健康猪的假阳性率前者未出现，而后者有１０％以上。从患病猪血清和抗原稀释度试验证实，ＲＣＩＥＰ的敏感性较酶标对流（ＥＬＣＥＰ）和常规ＣＩＥＰ分别高１５倍和４００倍。因此作者认为ＲＣＩＥＰ可作为猪弓形虫病的一种特异诊断新方法。     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

A sero-epidemiological survey of Toxoplasma gondii infection in free-range and caged chickens in northeast China

Acquisition of Toxoplasma gondii infections is mainly through ingestion of parasite-contaminated food. T. gondii oocyst distribution in the living environment of human and livestock is directly linked to the prevalence of the parasite infection in humans and domestic animals. In this study, we investigated the sero-prevalence of T. gondii infection in free-range as well as caged chicken in northeast China. The purpose of this study was to investigate the potential prevalence of T. gondii oocysts in the environments. Sera of 308 free-range chickens and 210 caged chickens collected in three areas in northeast China were tested for anti-T. gondii antibodies with ELISA assays. The infection rates of free-range and caged chickens were 34.7% and 2.8% respectively, indicating that the parasite is widely distributed in the environment and poses threatens to the health of people living in those areas.     

猪弓浆虫病的诊治与虫体分离

江西某农场的猪种猪和肥猪几乎几时暴发以高热为特征的疫病，病理变化主要为淋巴结出血、肿大脾脏、肝脏肿大，肺炎、心脏出血。肺门淋巴结触片多见量弓浆虫滋养体，病猪血清的弓浆虫抗原，抗体均阳性。接种病料的小鼠于接种后２５天死亡，分离出一株弓浆虫，因此诊断猪场种场和肥猪暴发的疫病与弓浆虫病，并推测本次弓浆虫病的病原来自饲料中的鱼粉。     

青海省部分地区藏獒及草地鼠类弓形虫抗体间接血凝试验检测

应用间接血凝试验(IHA),对青海省部分地区的藏獒、喜马拉雅旱獭、高原鼠兔及中华鼢鼠的311份血清样品,进行弓形虫特异性抗体的检测。结果检出33份阳性血清,阳性率为10.61%。     

弓形虫保种与转种的简易方法

采用小鼠传代与体外4℃冰箱保存相结合的方法，对弓形虫虫株进行保种，转种成功率达100％，为虫株的保存提供了又一种简便可靠的方法。     

地鼠肾细胞弓形虫培养的实验研究

本文报道用正常地鼠肾细胞进行弓形虫培养的实验研究。接种虫体２×１０￣６个时，第２天细胞出现病变，第４天及第６天虫体繁殖逐渐增多，第７天虫体比原增殖达２６倍，到第９天以后虫体增殖逐渐减少。我们还对不同稀释度（１：２０，１：４０，１：８０，１：１６０）的弓形虫抗原量接种细胞进行观察，结果显示接种１：２０抗原液的一组，第５天观察到细胞严重受损，而接种１：１６０抗原液的一组则细胞变化不明显，展示抗原的接种量与虫体增殖有关。本研粉虽然比小白鼠传代腹水培养工作量大，但可获得足够量的抗原，而且地鼠肾细胞培养，取材方便。此法既可作制备抗原和分离用，又可传代、保种，是一种较好的方法。     

弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制

将样品垫（加样区）、包被了弓形虫排泄分泌抗原和胶体金结合物的结合垫、包被了弓形虫排泄分泌抗原和抗弓形虫抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾互相衔接粘贴在白色塑料板上，组装成检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条。然后用其进行动物弓形虫病血清抗体检测，并用弓形虫IHA诊断试剂进行对照试验。经对已知弓形虫阴、阳性血清检测，与弓形虫IHA检测结果的符合率为82．5％，金标试纸条较弓形虫IHA诊断试剂能提前2d检测到抗体。结果表明，检测弓形虫抗体免疫胶体金试剂（金标试纸条）的敏感度高于IHA。     

癸氧喹酯抗寄生原虫作用研究现状

癸氧喹酯(decoquinate,DQ)作为畜禽抗球虫药使用已有50多年历史,因其高效、低毒、低残留等特点而备受关注。DQ主要通过破坏虫体线粒体细胞色素bc1复合体的电子传递而捕获子孢子和第一代裂殖子的发育而发挥作用。家禽球虫易产生突变而较快产生抗药性,而反刍动物球虫少有抗药性的报道。除抗球虫作用外,DQ对疟原虫和弓形虫具有很好的控制效果,对隐孢子虫和肉孢子虫的作用还需要研究确认。近年研究表明,DQ纳米颗粒和衍生物具有更强的抗疟活性,值得深入研究。通过查阅国内外相关文献,综述了DQ抗几种常见寄生原虫的研究进展,为其合理使用提供借鉴。     

屠宰羊弓形虫感染情况调查

为了保障羊肉制品的生物安全,对屠宰羊进行弓形虫感染情况调查以及对羊肉进行弓形虫检测。采用间接血凝试验,对677份屠宰羊的血清进行了弓形虫抗体检测。结果显示,弓形虫抗体阳性有47份,阳性率为6.9%。