表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

本研究根据GenBank数据库中的猪圆环病毒2型全基因组序列设计并合成了1对能扩增完整Cap序列的引物,采用PCR扩增猪圆环病毒2型YZ株的Cap基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBacHTA-Cap;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有Cap基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap转染sf9昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒rBacmid-Cap,该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒2型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.     

抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建

根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码19个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列一致,同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1_SFc,为外源基因在pcDNA3.1( )中的表达与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础。     

猪圆环病毒2型山东分离株全基因组的克隆与序列分析

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因组序列,设计一对特异性引物,从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中扩增出PCV-2基因组DNA,将基因片段克隆于pMD18-T载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒pMD18-T-PCV-2。对筛选出的阳性质粒进行测序。结果表明,PCV山东株的全基因组为1 767 bp,与国内外毒株核苷酸同源性高达99.6%。     

猪附红细胞体特异性基因的克隆和PCR诊断方法的建立

根据2003年Hoelzle发表的猪附红细胞体的基因组序列（AJ504999）设计一对特异性引物,对病料样品进行PCR扩增并将其产物克隆到pMD18-T载体后测序,结果表明扩增出的片段为603bp,同源性分析表明该序列与参考基因组序列同源性为100％,反映出我国分离株与国外株其基因无差异,特异性和敏感性试验表明,所建立的PCR诊断方法与常见的支原体、细菌及原虫无交叉反应,能检测到猪附红细胞体血液基因组DNA最低量为0．65ng／mL,该方法具有快速、特异、敏感等特点,为猪附红细胞体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。     

诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建及鉴定

通过PCR方法分别从pGL3-Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA;利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,并从pGcFRT2NeoR上用Xhol Ⅰ和Sal Ⅰ酶切得到FRT2NeoR盒子.将上述4个片段利用SOE-PCR及T5 DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体pET28a(+)构建Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.用LipofeetamineTM2000介导转染猪成纤维细胞,G418筛选阳性细胞,PCR鉴定.结果表明,成功构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,并成功整合到猪成纤维细胞的基因组中,获得了诱导性表达Cre重组酶的转基因猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得诱导性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础.     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及表达质粒的构建

根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组序列(登录号:NC_015153.1),针对其中的信号识别颗粒(SRP)基因设计合成一对特异性引物,应用PCR方法扩增猪附红细胞体信号识别颗粒54 (SRP54)基因片段,克隆至pMD18-T simple载体上,经PCR、酶切初步鉴定正确后进行测序,对所克隆片段进行生物信...     

猪附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据基因库中已登录的猪附红细胞体新的基因组DNA序列设计引物,从疑似猪附红细胞体(Mycoplasma suis)感染猪全血样品基因组DNA中扩增出了预期长度666 bp的目的DNA片段,通过对24份临床疑似病例样品的PCR扩增及其他病原微生物基因组DNA的特异性扩增试验,建立了E.suis的PCR诊断方法;进一步对PCR产物克隆、测序分析表明,与国外已报道的AJ504999株相关区域核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.19%和96.85%,表明我国分离株与国外株基因组存在差异。     

猪胸膜肺炎放线杆菌整合膜蛋白基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的保护性免疫机制,试验采用筛选APP3～8kb随机基因组文库的方法获得1株阳性克隆,经测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为APP整合膜蛋白(IM)基因,预计成熟蛋白分子质量为48.431ku。根据序列设计特异性引物并PCR扩增该基因,分子克隆表达该整合膜蛋白。Western-blot分析表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应,说明该蛋白在免疫应答中起作用。     

蒙古绵羊Ghrelin基因的克隆和原核表达

为了克隆蒙古绵羊Ghrelin基因,构建其原核表达载体,并检测其在大肠杆菌中的表达情况.本研究用RT-PCR方法从蒙古绵羊胃组织mRNA扩增获得Ghrelin基因的cDNA序列,克隆到pMD-19T载体后进行序列分析.将测序正确的cDNA序列与原核表达载体pET-32a(+)连接,并转化BL21( DE3)大肠杆菌.经...