猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪链球菌2型三种毒力因子CP2SJ、MRP、EF基因序列,利用Primer Express 3.0软件分别设计3对特异性的引物及相应的Taqman探针。CP2SJ、MRP、EF探针5′端分别标记FAM、HEX、CY5荧光发射基团,3′端标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的三重荧光定量PCR,可同时检测上述三种毒力基因。该方法灵敏度高,CP2SJ、MRP、EF的最低检测限分别为90、40、60拷贝数/μL的质粒;特异性强,与其他病原菌无交叉反应;重复性好,变异系数均小于3%。整个检测扩增在60 min内完成。以上结果表明本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型三种毒力因子。     

DSN结合CHA用于miRNA的可视化检测

为了研究灵敏特异、方便快捷的新型microRNA(miRNA)检测技术,试验采用双链特异性核酸酶(DSN)结合CHA(catalyzed hairpin assembly)恒温核酸扩增技术产生的双重信号放大方法,以试纸条作为信号输出方式用于miRNA的检测,将含有miRNA识别部分和CHA启动序列的复合探针与靶标miRNA结合后,DSN循环反应酶切释放CHA的启动序列T-trigger并引发CHA反应,最终产物可在试纸条检测线上留下红线。结果表明:本体系最低检测限可达到7.66 pmol/L,灵敏性好,且除靶标miRNA-21外,其余非特异性靶标均不能使试纸条留下红线,即使单碱基也能够被很好地区分,特异性强。说明本研究成功建立了等温、灵敏、特异的miRNA检测新方法,可用于miRNA的便携分析。     

猪瘟病毒和猪圆环病毒2型二重荧光LAMP检测方法的建立

建立二重荧光LAMP方法,检测猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)。根据CSFV E2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PCV2序列的特异性引物和2条标记不同的荧光基团探针,在CSFV探针序列5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PCV2探针序列5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。以设计合成的引物、探针以及LAMP反应试剂建立二重荧光LAMP检测方法区分CSFV和PCV2,对该方法中的反应体系进行优化,并进行特异性、敏感性和干扰性测试以及临床样品验证测试。结果表明,建立的方法可鉴别CSFV和PCV2,特异性试验显示,该方法只检测出CSFV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。该方法最低检测CSFV或PCV2为100拷贝/μL,敏感性好。临床样品的检测结果与荧光定量PCR检测结果一致。建立的CSFV和PCV2二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,可适用于CSFV和PCV2的鉴别检测。     

猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法的研究

以猪附红细胞体和多种血营养菌16S rRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r,在反向引物的5′端用生物素标记,以猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的可变区序列设计种特异性寡核苷酸探针,探针的5′端用地高辛标记,成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。通过测定不同浓度PCR产物对应的微孔板杂交-酶反应显色OD值,用SPSS统计软件进行回归分析,得到回归方程为y=2.1012-0.4492×logx,其相关系数R为0.977,显示对未知样品可进行定量检测。该方法与猪的多种细菌性病原、猫血巴尔通氏体CA株和E.wenyonii无交叉反应,其敏感性比常规PCR琼脂糖电泳检测提高了近100倍。用建立的方法对38份临床样品进行检测,结果有12份检测结果为阳性。     

副溶血弧菌主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快捷、准确、高效检测副溶血弧菌的方法,以副溶血弧菌种属特异性基因toxR和毒力因子tdh、trh基因序列,分别设计3对特异性引物及相应TaqMan探针,并在toxR、tdh和trh基因的3个探针的5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端标记BHQ1淬灭荧光基团,通过优化反应体系和反应参数,确定最佳反应体系,建立一种基于Taq Man探针定量检测副溶血弧菌的三重荧光定量PCR方法。结果:本试验所建立三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限亦达到10 CFU/m L,且整个检测扩增时间大约为1 h。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好且耗时短,是高通量检测致病性副溶血弧菌的有效手段。     

杂交链式反应结合免疫层析试纸条检测MicroRNA-155的研究

为了建立无酶、快速、可视化高灵敏检测生物标记物MicroRNA-155的方法,试验采用杂交链式反应结合免疫层析试纸条的方法对MicroRNA-155的检测进行了研究。结果表明:MicroRNA-155可以与标记有FAM的捕获探针和检测探针特异性结合,检测探针会启动标记Biotin的茎环结构探针H1、H2进行恒温扩增杂交链式反应(HCR),实现信号放大。核酸试纸条(LFNAB)结合垫上包被有链霉亲和素(SA)的纳米金(Au-NPs),检测线上有Anti-FAM,当同时含有FAM与Biotin的结构时,会在检测线上显红色,进而实现对靶标的检测。该方法的灵敏度较高,特异性良好,检测下限可达到0.1 nmol/L。说明基于恒温扩增杂交链式反应结合核酸试纸条可高灵敏地检测人类肿瘤生物标记物MicroRNA-155。     

酶联免疫吸附（ELISA）法测定生猪尿液中的沙丁胺醇

将标准品、样品和和酶标记物一并加入到微孔板中孵育,样品中的游离沙丁胺醇与酶标记的沙丁胺醇竞争结合酶标板微孔中固定相化的沙丁胺醇特异性抗体,通过清洗步骤洗掉未结合的酶标记沙丁胺醇,再通过酶的专一性显色剂显色,微孔显蓝色,加入反应终止液使颜色由蓝色转为黄色。在450nm处测量吸光度（OD）值,并设置标准曲线,通过标准曲线测定样品中沙丁胺醇的含量,结果显示：OD值的大小与样品中沙丁胺醇的含量成反比。     

基于绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白间接ELISA方法的建立

为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PRRSV和PCV2。     

应用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒研究

用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒,阳性反应呈典型的S曲线,说明本检测探针和引物设计合理。经灵敏度测定,当样品DNA浓度低至100拷贝/μL时,仍可以有效扩增,但在103/μL之上时结果最佳。同时,经过与传统探针检测对比试验得出:用Taqman标记的探针检测相同量的样品时,AllGlo MAR标记的探针(FAM通道)CT值与FAM标记的探针的CT值没有明显区别,但是MAR标记的探针的荧光信号强度要比FAM标记的探针约高40%,更适合于对虾白斑综合征病毒的检测。     

鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的血清学方法,本试验以IBV为检测抗原,建立了一种检测IBV抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化.研究结果显示,抗原的最佳包被浓度为19.2 μg/mL,最佳包被条件为37 ℃ 1 h后4 ℃过夜;血清的最佳稀释度为1:800,37 ℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1:7 000,37 ℃孵育60 min;底物显色为37 ℃避光作用10 min.经特异性、重复性、敏感性试验证明,该方法与鸡常见病原的阳性血清均无交叉反应,重复性较好及血清稀释至1:12 800时仍可检测到IBV抗体.结果表明,本试验所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性.     

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

对AEV陕西分离株VP1基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化.结果表明,VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为50 000的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被质量浓度3.8 mg/L,37℃2h后4℃过夜,1％ BSA 37℃封闭2h,待检血清1∶50稀释37℃孵育0.5h,酶标抗体1:4 000稀释,37℃作用30min,底物37℃显色5 min,临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率为91.9％.该方法可用于临床样品的大批量检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于TaqMan探针的双重荧光PCR技术检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据IBRV gB基因序列和BVDV 5′端非编码区序列的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1条FAM标记的TaqMan探针,1对BVDV的特异性引物和1条ROX标记的TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR检测IBRV和BVDV的方法。对建立的检测方法进行特异性和敏感性测定,并用临床样品进行检测验证。特异性试验结果显示,该方法检测参试的IBRV毒株,在波长530μm(FAM)时收集到特异性荧光信号曲线,检测参试的BVDV毒株,在610μm(ROX)时收集到特异性荧光信号曲线,无交叉信号出现,对照的毒株无论是在530μm(FAM),还是610μm(ROX)处,均无荧光信号曲线出现,方法的特异性好;敏感性试验结果显示,该双重荧光定量PCR可检测到100个拷贝的IBRV和BVDV质粒DNA模板;临床样品检测结果表明,对保存在-70℃的127份牛病料样品核酸进行检测,IBRV阳性12份,BVDV阳性26份,IBRV和BVDV同为阳性2份,为混合感染,检测的拷贝数分别为6.24×105和6.32×104拷贝/μL。阳性样品经序列比对分析,分别与IBRV和BVDV的序列100%同源。建立的双重实时荧光定量PCR方法检测IBRV和BVDV具有特异、敏感等优点,可用于临床样品的鉴别检测。     

TTMV间接ELISA检测方法的建立

以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示：抗原最佳包被浓度为1．63μg／mL,37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1：320;酶标二抗孵育时间为37℃60min;ELISA酶标板的临界值为0．211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34．68％和39．74％。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。     

猪细环病毒数字PCR定量检测方法的建立

[目的]实现猪细环病毒(TTSuV)的准确定量检测。[方法 ]根据TTSuV的序列特点,设计特异性引物、探针,建立数字PCR检测技术。对数字PCR反应体系中的引物和探针浓度进行优化,分析方法的灵敏度、特异性,并初步应用于进行临床检测。[结果 ]最终确定TTSuV1a和TTSuV1b数字PCR反应体系中最佳引物浓度均为250 nmol/L,最佳探针浓度均为300 nmol/L,TTSuV1a型和TTSuV1b型灵敏度均可达到单个拷贝数;以猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,结果无交叉反应;批内和批间试验表明,该方法的重复性良好;本实验室留存的92份血清样本的检测结果与其背景信息一致。[结论 ]本研究建立的TTSuV数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于TTSuV的定量检测。     

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank公布的大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfb E、鞭毛抗原基因fli C、溶血素基因hly A、紧密黏附素基因eae A和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfb E/eae A、Stx1/hly A、fli C/Stx2探针5'端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端均标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度高,stx1、rfb E、fli C、eae A、hly A、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8 h后测得大肠杆菌O157:H7的最低检出限分别为200 cfu/m L与1 cfu/m L。以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的方法。     

大肠杆菌O_(157):H_7 PCR-ELISA检测方法的建立

为了建立大肠杆菌O157:H7微孔板固相捕获呈色探针快速检测方法,试验根据GenBank网站公布的大肠杆菌O157:H7血清型基因序列设计1对特异性引物和探针,进行聚合酶链式反应、核酸杂交、酶联显色,测定吸光度值,并对此快速检测方法的特异性和敏感性进行研究。结果表明:大肠杆菌O157:H7吸光度值为2.214,敏感性试验最低检测限为每25 mL菌液中有1 cfu。     

禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法的建立

为建立一种特异、灵敏、简便、快速的禽流感病毒H5亚型的检测方法,根据近几年流行的禽流感病毒H5亚型毒株HA基因序列,采用DNAStar生物分析软件进行基因序列比对后,选择相对保守区域,设计多对引物及探针,建立了禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法,对该方法的反应条件进行优化并检测特异性和灵敏性。结果显示,建立的检测禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA方法特异性强,只有禽流感病毒H5亚型呈阳性,其他均为阴性;灵敏性较高,最低可检测到质量浓度为0.89×10-3 mg/L的禽流感病毒H5亚型核酸,比实时荧光RT-PCR方法灵敏性低10倍;检测快速,检测反应所需时间仅20min,比实时荧光RT-PCR方法缩短近1h。结果表明,所建立的禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法适应于禽流感病毒H5亚型的现场检测,以及基层实验室的推广应用。     

鉴别欧洲型和美洲型PRRSV荧光定量RT-PCR方法的建立

为了建立鉴别欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量RT-PCR方法,根据欧洲型和美洲型PRRSV的M基因保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够鉴别欧洲型和美洲型PRRSV的双重双色荧光定量RT-PCR方法。该方法的重复试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为1.30%和1.96%;灵敏性及特异性试验表明其检测下限为1×101copies/μL,而且与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该检测方法的建立为不同型别的PRRSV快速诊断提供了有效手段,能够应用于临床样品检测。