同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒（CSFV）及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT—PCR方法。该方法可检测到3．2TCID50的CSFV和1．8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT—PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT—PCR的符合率高达99．4％。该复合荧光定量RT—PCR方法敏感、特异、重复性好。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR快速诊断技术研究

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）的N基因序列设计了一对引物，建立诊断PRRSV的RT—PCR技术。使用该方法对山东某些地区疑似为PRRS的28份送检样品进行检测，结果4份为阳性，证实山东存在PRRSV的流行。RT—PCR方法的建立为PRRS的快速、准确诊断以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段。     

PRRSV经典株与变异株RT—PCR鉴别方法的建立及应用

根据高致病性堵繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物。通过对PCR体系、温度及循环次数等条件进行优化,建立了一种能够鉴别诊断高致性PRRSV和经典PRRSV的RT—PCR方法。应用此RT—PCR方法,对来自江西周边地区的283份临床病料进行检测,204份结果为PRRSV阳性,阳性率72．08％。单纯PRRSV变异株感染163份（163／283）,占57．60％;PRRSV经典株与PRRSV变异株混合感染39份（39／283）,占13．18％;单纯PRRSV经典株感染仅为2份（2／283）,仅占0．71％。由此说明目前主要流行的还是高致病性PRRSV,PRRSV变异株阳性率很高,可能与该病毒在猪群中的持续感染特性有关。     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

参照国内外已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF7的基因序列及其相关的RT—PCR检测方法设计一对引物,扩增目的片段为535bp。通过对RT—PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了一种PRRSV的RT—PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PRRSV的检测、流行病学调查等。应用此方法对临床样品进行了检测,阳性检出率达66．79／5。     

PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT-PCR方法的建立与临床应用

通过对GenBank已公布猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）普通株与变异株Nsp2基因序列进行比对分析,设计合成3条引物,建立一步鉴别诊断普通株与变异株PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明,PCR扩增获得的普通株片段大小为267bp,变异株片段大小为180bp。敏感性试验结果表明该方法具有较高的敏感性,能检测到含量为1.5pg的核酸含量;特异性结果表明该方法在同等条件下检测PRV、CSFV、PCV-2、JEV、CPV、TGEV、SIV均为阴性。对2009-2010年送检的100份临床样品进行检测,结果检出26份变异PRRSV,8份普通PRRSV,阳性率为34%;与ELISA抗体检测试剂盒比较,多检出4份阳性样品。表明建立的鉴别诊断PRRSV的RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,适用于临床针对PRRSV的检测。     

一步法RT—PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法建立及应用

根据GeneBank公布的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）美洲型毒株VR-2332序列设计了一对特异性引物P1／P2,扩增片段为508bp,从而建立了检测PRRSV的一步法RT—PCR蛤测方法,特异性试验表明,该引物均不能扩增其它常见的与繁殖障碍有关的病毒基因。敏感性实验表明,该引物可以检测到10^-5TCID50的病毒含量。利用该方法对青海某猪场中20份临床上疑似PRRS的组织进行检测,其中16份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为80％,表明建立的该方法完全可以快速检测组织中的PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSV ORF7、PCV-2 ORFl基因及PRV TK基因的核苷酸序列设计合成引物，建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV-2的RT-PCR及PCR方法。应用该方法对77份可疑病料进行了检测，以调查猪群中PCV-2与PRRSV和(或)PRV混合感染情况。结果表明，24份样品表现为PRRSV与PCV-2混合感染，占样品总数的31．2％；17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染；9份样品表现为PCV-2与PRV混合感染，占11．7％；另外，还有一定比例的三重感染，共8个样品，占10．4％。结果显示，猪群中PRRSV、PRV与PCV-2的混合感染现象比较普遍。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核衣壳蛋白编码基因序列设计了一对特异性引物P1／P2。扩增出大小为294bp的目的片段；再针对这个基因片段。设计合成4条寡核苷酸探针。其中反向引物的5’端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础。通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测。建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测。与RT—PCR检测方法相比。本方法具有良好的特异性和敏感性。试验结果表明用该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的，对该病的进行快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。