猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达

参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物，用PCR法扩增apxⅠA基因，获得了3069bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定和序列分析，表明克隆是成功的。再将长为1149bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N-端的片段)插入到原核表达载体pET-28(a)中，构建了重组表达质粒pET—apxⅠA，转化大肠埃希氏菌JM109(DE3)，在IPTG诱导下获得了高效表达，经SDS-PAGE检测，证实表达产物大小约为41ku。     

胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立

根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL ISA检测方法奠定了基础     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的细菌性呼吸道传染病。Apx毒素(actinbacillus pleuropneumoniae toxin)是由胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类溶血毒素,在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中,Apx毒素起了重要的作用。     

胸膜肺炎放线杆菌的主要毒力因子及其致病性研究进展

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneum oniae,APP)的毒力因子有很多,其中主要包括外毒素、脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、黏附素等,这些毒力因子都能引起胸膜肺炎的发生。1 APP的主要毒力因子及致病性1.1外毒素目前为止已经发现胸膜肺炎放线杆菌可以产生4种毒素。这些毒素都属于RTX(R epeat in structure Toxin)毒素家族,且不同血清型的APP所分泌的毒素种类不同,毒素的溶血性及细胞毒性也不同,因此可以作为分型的依据[1]。ApxⅠ和ApxⅡ具有溶血活性和细胞毒性作用,而ApxⅢ只有细胞毒性作用。ApxⅠ溶血活性强于…     

胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。     

猪传染性胸膜肺炎新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究

利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，提取表达产物包涵体，再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌，和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗，免疫BALB／c小鼠，间隔2周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素I、Ⅱ、Ⅲ的EuSA抗体和7型菌的血凝抗体，第2次免疫2周后用5LDso的猪胸膜肺炎放线杆菌1型、7型菌株进行攻毒。结果发现第2次免疫后抗体水平显著升高，用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为83．3％和91．7％，从死亡小鼠的体内分离到了攻毒菌株，初步的动物试验表明此种新型亚单位菌苗对同型和异型的APP菌株具有较好的保护力，为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的分子生物学与致病机理

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(App)引起的猪的一种呼吸道传染病.到目前为止,APP已经被分离鉴定出了15种血清型(1～15).15种血清型的APP能产生属于RTX毒素家族的4种Apx毒素,分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ.ApxⅠ操纵子包含有ApxⅠ C、A、B、D 4个基因;ApxⅠ毒素含有13个富含甘氨酸的重复区.ApxⅡ操纵子仅包括结构基因ApxⅡA和激活基因ApxⅡC,而无分泌基因;ApxⅡ蛋白含有8个甘氨酸的序列重复.ApxⅢ操纵子与ApxⅠ操纵子相同,具有一个完整的操纵子;ApxⅢ在N～末端有3个疏水区,在C末端部分有13个富含甘氨酸的区域.Apx毒素的致病机理为先由没有活性的前体蛋白转变为有活性的ApxA蛋白,再由有活性的ApxA蛋白侵害细胞.     

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25—4株为研究对象，对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序，并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E．coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在，包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western—blotting免疫印迹实验，结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。     

育肥猪传染性胸膜肺炎的诊断及分离菌毒力基因检测

<正>猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染所引起的一种高度接触性、致死性呼吸系统疾病,以急性纤维素性胸膜肺炎、出血坏死性肺炎或慢性局灶性坏死性肺炎为特征~([1])。目前研究发现,APP有4种外毒素,即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ,是APP的主要毒力因子~([2])。     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxIV基因缺失突变株的构建和鉴定

ApxIV是胸膜肺炎放线杆菌的一种RTX毒素,为探究其在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中的作用,以血清7型APP HB04为亲本菌株,通过接合转移和负向筛选方法,构建了一株apxIV基因缺失突变株。通过PCR、序列分析、Southern blot分析及遗传稳定性分析等证明成功构建了突变株。对突变株生物学特性进行初步研究,发现突变株与亲本菌株相比,体外生长速度未发生明显变化,对小鼠的致病力有所降低。结果表明,毒素ApxⅣ在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中发挥一定作用。突变株的成功构建及生物学特性研究为进一步阐明胸膜肺炎放线杆菌的致病性及开发更为安全、高效的基因工程疫苗奠定了坚实基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠；设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1149 bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41 ku的rApxⅠA作为包被抗原,用间接ELIS...     

1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、毒素基因检测、分型及药敏试验

2018年12月,浙江慈溪某规模化猪场部分肥猪出现体温升高、呼吸困难、咳嗽等症状,疑似感染了猪传染胸膜肺炎放线杆菌。取该猪场病死猪的肺脏进行细菌分离和纯化,对分离菌株进行了革兰染色镜检、16S rDNA PCR鉴定、血清型鉴定及生物型鉴定,最终确定该菌株为生物Ⅰ型、血清型15型传染性胸膜肺炎放线杆菌。Apx毒素鉴定结果表明,该菌株含有Apx II,Apx III和Apx IV毒素基因;药敏试验结果显示,分离株对头孢曲松、恩诺沙星、氨苄西林及复方新诺明较为敏感,对链霉素具有较强的耐药性。     

胸膜肺炎放线杆菌3种Apx毒素及外膜蛋白Omp2的原核表达及免疫反应性鉴定

猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的PCR鉴定

据胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）生物I型各血清型之间外毒素（apx）基因组结构差异,参考GenBank上已发表的4种毒素（apxⅠ/apxⅡ/apxⅢ/apxⅣ）的核酸序列设计了6对特异性引物,对APP的12个血清型进行多重PCR扩增,得出不同的特异性的扩增片段,得以准确鉴定APP生物I型中的9种血清型,但其中血清型2和8,血清型5、9和11仍未能区分。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因的克隆和表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌溶血素(Apx)ⅣA基因的原核表达,试验采用PCR方法扩增到目的片段,并将该片段连接到pMD18-T载体中,经PCR和限制性酶切鉴定后,在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段与pET28a连接。结果表明:ApxⅣA基因测序结果与GenBank中公布的核苷酸序列的同源性达100%,说明已成功构建猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-pET28a原核表达质粒;表达质粒经IPTG诱导成功表达了36 ku的ApxⅣA原核蛋白。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒的研制

根据GenBank中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因序列,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带为600 bp,特异性与敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为50 CFU/mL,而对金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。-20℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对41份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与细菌学检测结果相一致。结果表明,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒能够对APP临床样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及药敏试验

2015年3月,江西省上饶市万年县某规模化养猪场部分肥猪出现体温升高、呼吸困难、咳嗽等症状,部分发病猪出现死亡,病死率为35%,疑似猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染。用TSA及鲜血培养基进行了胸膜肺炎放线杆菌的分离和纯化,经培养特性、染色镜检、生化试验及16SrDNA PCR鉴定等证明了分离菌为生物Ⅰ型胸膜肺炎放线杆菌。毒力基因检测表明该菌具有ApxⅣ毒力基因。药敏试验结果显示,分离菌对头孢哌酮、诺氟沙星高度敏感,对青霉素G耐药。