大肠杆菌K88,K99双价基因苗预防仔猪黄白痢试验报告

引起仔猪黄痢、白痢的埃希氏大肠杆菌荚膜抗原主要有K_(88)、K_(99)、987P、F_(41)四种,而K_(88)、K_(99)抗原型的大肠杆菌最为常见,也是引起仔猪黄、白痢主要血清型的大肠杆菌.为了探讨大肠杆菌K_(88)、K_(99)双价基因工程冻干菌和抗痢宝对仔猪黄、白痢病预防效果,作了本试验.     

孕猪应用K88、K99灭活菌和葸诺沙星预防仔猪黄白痢

仔猪黄白痢一直严重影响着养猪业的发展,因而在防治上普遍受到养猪场、户的重视,应用大肠杆菌基因工程双价K88、K99灭活苗结合葸诺沙星注射怀孕母猪,预防仔猪黄、白痢取得了较好的预防效果。     

应用高免卵黄抗体防治仔猪黄痢的研究

以K88+、K99+和987P+ETEC活菌对初生未吃初乳的大白仔猪攻毒.发病后,采用口服型特异性高免卵黄抗体粉剂进行治疗.结果表明,ELISA效价为1:625和1:2 500的高免卵黄抗体粉剂可有效治疗发病仔猪,治愈率为100%,对照组的死亡率分别为86%、100%和80%;ELISA效价为1:256的高免卵黄抗体粉剂治疗效果较差,试验组和对照组的仔猪发病率和严重程度无显著差异(P＞0.05).本研究为仔猪黄痢的防治提供了一种新的有效手段.     

仔猪黄白痢与仔猪红痢的诊断及防治方法

1仔猪黄白痢仔猪黄白痢的致病菌是大肠埃希氏菌,为革兰氏染色阴性菌,有菌毛（K88、K99、987P）并能产生肠毒素。幼龄猪常发,头胎多发。黄痢（早发性大肠杆菌病）发生于1~7日龄仔猪,白痢（迟发性大肠杆菌病）发生于10~30日龄仔猪。本病每年各季均可发生,在冬、夏或春季温差大时易发。该病占新生仔猪     

仔猪黄、白痢的综合防治

1日常防制措施1.1妊娠母猪饲养管理疫苗的接种常选用以下几种疫苗。仔猪黄痢油剂苗,母猪临产前20-40天,肌肉注射,对仔猪黄痢的预防效果较好。大肠杆菌遗传工程活菌苗,母猪临产前20-25天口服,对仔猪黄白痢均有效。仔猪腹泻基因工程K88、K99双价灭活苗,母猪产前21天左右耳根皮下注射,主要预防仔猪黄痢。仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗K88、K99、K987P,母猪产前15天、40天各肌肉注射一次,预防仔猪黄白痢。     

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛疫苗的制备及小鼠免疫试验

为了更好地预防仔猪黄痢，选取野生分离菌株HN2001（K88ab）、HN2002（K88ac）、HN2003（K88ad）、HN2004（K99）、HN2005（987p）和HN2006（F41）培养后用低温磁力搅拌法提取菌毛，制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗。试验结果表明，5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95．0％，为进一步进行本体动物试验提供了有价值的参考资料。     

产肠毒素大肠杆菌K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究

为研究K88ab/K88ad菌毛对细胞的黏附作用,本研究分别以产肠毒素E.coli (ETEC) K88ab C83901株和K88ad C83903株基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增这两种K88菌毛操纵子fae基因(均约7.9 kb).将其分别克隆于表达质粒pBR322中构建pBR-K88ab和pBR-K88ad重组质粒,并将其分别转化至不含任何菌毛的E.coli SE5000株中.该重组菌能够分别与鼠抗K88菌毛阳性血清和抗K88菌毛单克隆抗体(MAb)产生凝集反应;在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛.采用热抽提法提取其体外表达的K88ab和K88ad菌毛,SDS-PAGE电泳检测结果显示,菌毛蛋白的分子量约为26 ku.玻板凝集试验和western blot结果表明:重组表达的K88ab及K88ad菌毛与K88+参考株菌毛均能够被抗K88菌毛阳性血清和MAb识别.以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型进行黏附和黏附抑制试验,结果表明表达K88菌毛的重组菌及K88+参考株均能够黏附于IPEC-J2上皮细胞表面;而且阳性血清和MAb能够有效抑制重组菌或K88+参考株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合.     

抗大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备和鉴定

为了研究用不耐热肠毒素B亚基(LTB)和耐热肠毒素(STa)的融合蛋白制备鸡卵黄抗体的方法及其中和作用,试验将LTB和STa的编码基因串联并在大肠杆菌中表达获得了重组蛋白,以重组蛋白为免疫原免疫8月龄海兰蛋鸡制备了卵黄抗体,分别用兔肠段结扎试验和乳鼠灌胃试验进行了卵黄抗体对不耐热肠毒素(LT)和STa的体内中和试验。结果表明:用LTB和STa融合蛋白免疫产蛋鸡可诱导产生抗LTB和STa的卵黄抗体,其中抗LTB效价最高可达1∶8 647,抗STa效价最高可达1∶768;卵黄抗体对LT和STa均有中和作用。说明用融合蛋白作为免疫原制备的卵黄抗体具有抗LT和STa的生物学活性,对仔猪大肠杆菌性腹泻的临床治疗有潜在的应用价值。     

共表达K88/987p菌毛产肠毒素性大肠杆菌的分离鉴定及其卵黄抗体的制备

为制备针对一些大型养猪场产肠毒素性大肠杆菌(enterotrxigenic Escherichia coli,ETEC)分离株的特异性卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin,IgY),试验对从这些养殖场分离的ETEC分离株菌毛基因类型进行了PCR鉴定,纯化该分离株的菌毛蛋白免疫蛋鸡制备IgY,对该IgY的效价、特异性和体外抑菌效果进行了检测。结果表明,该分离株具有K88和987p 两种菌毛基因,纯化后的分离株菌毛具有较强的免疫原性,经3次免疫后产生的IgY对K88和987p全菌和菌毛的效价可达到1:64 000,分离株菌毛IgY能特异地与K88和987p反应,与K99、F41无交叉反应,5 mg/mL分离株菌毛IgY在体外具有很好的抑菌效果。     

仔猪三痢苗与K88K99双价苗的对比观察

在临床实践中，为了预防仔猪黄痢、白痢，可以通过母猪产前注射仔猪三痢苗，获得较好的预防效果。为检验仔猪三痢苗的疗效，在临床中进行了仔猪三痢苗与基因工程K88K99双价苗的免疫效果对比试验，现将结果报道如下。     

产肠毒素性大肠杆菌K88与K99菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E.coli K88、K99基因序列,分别设计合成1对引物.利用PCR技术,以大肠杆菌C83907和C83644的质粒为模板分别扩增不含信号肽的K88及K99基因.通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切,连接和转化,构建了含K88-K99串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pETK88CK99).结果显示,经酶切,PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETK88CK99中含有K88K99融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量占菌体蛋白的40%左右,经Western blotting检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99标准血清识别.结果表明,构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株.     

Detection of K88 and K99 fimbrial antigens on Escherichia coli by coagglutination

Coagglutination was used to detect K88 and K99 fimbrial antigens on Escherichia coli, and results were compared to an enzyme immuno assay (EIA). When pili suspensions were tested by both methods, 28 of 66 cultures were shown to have K88 and 11 of 31 cultures had K99 antigens. No pili suspensions were positive by coagglutination that were not positive by EIA. Testing of cell suspensions gave equivalent results to pili suspensions for K99 when tested by coagglutination. Two cell suspensions reacted with the K88 coagglutination which could not be confirmed by testing of pili suspensions, while a further 20 out of 43 cultures gave equivalent results with both cell and pili suspensions for K88 when tested by coagglutination.     

Plasma vitamin K concentration in horses supplemented with several vitamin K homologs

The effect of several vitamin K homologs on plasma vitamin K concentration was determined to assess their potential as a vitamin K supplement for adult horses. Sixteen Thoroughbred horses consisting of 8 mares and 8 geldings, aged 8.4 ± 3.6 yr and weighing 520.8 ± 36.1 kg, were allocated to 4 groups (n = 4). Each group was given phylloquinone, menaquinone-4, or menadione at 58 μmol/d, or no vitamin K supplement for 7 d. Plasma samples were collected before feeding, and 2, 4, and 8 h after feeding on d 7, and plasma concentrations of phylloquinone and menaquinone-4 were determined. Plasma phylloquinone concentration was greater in the phylloquinone group than in the other groups (P < 0.001). The phylloquinone concentration quadratically increased (P < 0.001) after feeding in the phylloquinone group but no changes in the plasma phylloquinone concentration were observed after feeding in the other groups. Plasma menaquinone-4 concentration was greater (P < 0.001) in the menadione group than the other groups, including the menaquinone-4 group. Menaquinone-4 concentration did not change (P = 0.192) after feeding in each group. Menaquinone-4 has been considered the most potent vitamin K homolog for bone metabolism; therefore, the present experiment indicates that menadione is a good source of vitamin K for bone health in horses because it is the only vitamin K homolog that increased the plasma concentrations of menaquinone-4.     

K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时,室温４０００ｒ／ｍｉｎ,离心３０分钟,收集沉淀菌体,用ＰＢＳ离心洗涤一次,沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中。三等分菌体悬浮液分别用超声波、冻融、热休克等方法处理后,室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟,取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜,沉淀蛋白经透析,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度,双向免疫扩散、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ试验测定其抗原性。结果表明,热休克法分离纤毛抗原是最好的方法,从Ｃ株Ｅ株分离得到的纤毛抗原,在分子量大小及对单抗亲和反应能力方面没有明显的差异。     

维生素K生产工艺进展

维生素K是重要的饲料添加剂。介绍了维生素K的种类、性质与生理意义。着重综述了维生素K的生产工艺。探讨了化学合成法生产维生素K的废液的治理途径,论证了微生物发酵法生产维生素K的可行性。     

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314 bp;最终确定dNTP终浓度0.4 mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25 μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。