猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结构蛋白ORF5基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a,得到重组表达载体pET-32a-GP5,转化大肠埃希菌BL21.用不同浓度的IPTG分别于37 ℃诱导.经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为31.4 ku;薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%.重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测.     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT—PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白基因(N基因)，并将其克隆到pET-32a载体，构建了高效原核表达载体pETN。将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明，插入片段序列与PRRSV美洲型ATCC VR2332株的ORF7核苷酸序列同源性达99．9％，与分离毒株的同源性达99．0％。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州爿离株ORF5基因原核表达的研究

通过对PRRSV贵州分离株（Guizhou-1）RNA的提取和RT-PCR方法扩增得到ORF5基因,成功构建原核表达载体pET-32a—ORF5,转化至宿主菌BL21（DE3）中,诱导蛋白表达,并对诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,得到了约42．9ku左右的表达蛋白,与预期大小相符,表明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在大肠杆菌中能表达,并具有一定的生物学活性。动物免疫试验表明纯化蛋白和包涵体均可刺激小鼠产生抗体,纯化蛋白的效果优于包涵体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病,引起猪严重繁殖障碍和呼吸道疾病。该病的病原体属于动脉炎病毒属,是一种不分节段的单股正链RNA病毒,含有8 个开放阅读框(ORFs),ORF1 编码非结构蛋白,ORF2~ORF7 编码结构蛋白。其中ORF7 编码的核衣壳(N)蛋白和ORF6编码的非糖基化基质(M)蛋白为优势结构蛋白。猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组存在广泛的遗传变异性,M蛋白和N蛋白在所有的毒株之间相对比较保守,可作为血清学诊断的靶抗原。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒在分子生物学方面的研究情况做作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白鼠源多克隆抗体并验证其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的ORF7基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组N蛋白,纯化重组N蛋白制成弗氏佐剂抗原,采用皮下多点注射法免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光法验证其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为390 bp的ORF7基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-32a-N构建成功,重组N蛋白分子质量约为28.0 ku,制备的多克隆抗体效价较高,重组N蛋白多克隆抗体按照1∶2、1∶4和1∶8比例稀释时,荧光数量与不加多克隆抗体时比较无明显区别。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组N蛋白,制备的鼠源多克隆抗体能够与重组N蛋白发生特异性反应,但没有抗PRRSV中和活性。     

猪繁殖与呼吸综合征基因免疫的初步研究

将猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要免疫蛋白基因ORF4和ORF5及ORF5和ORF7基因分别共同克隆到真核表达载体pIRES1neo中构建重组质粒,称为pIRESorf5/4和pIRESorf5/7。添加脂质体作为佐剂的表达质粒免疫BABL/c小鼠,经过三次免疫和采取血清,通过ELISA检测,其中pIRESorf5/7表达质粒产生较强的免疫应答,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒基因免疫应答以及研制基因疫苗奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.     

PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上，成功构建重组表达质粒pET5-ORF6。将共转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）感受态细胞，重组菌经IPTG诱导表达，其细胞裂解物经SDS－PAGE可检测到分子质量约为19ku的目的蛋白带，经薄层扫描分析，目的蛋白占菌体总蛋白的26．8％，采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测，结果表明表达的蛋白显示特异性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株ORF3基因的原核表达

通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。     

不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的克隆及其表达载体的构建

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的表达,研究参照GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株(PRRSV Guizhou-1)的核苷酸序列,利用DNASTAR、Oligo6.0和Primer Premier 5.0软件设计1对ORF5基因的特异性引物,同时将贵州大学动物科学学院分子生物学实验室分离、保存的PRRSV Guizhou-1接种于Marc-145细胞,产生明显细胞病变后收集病毒,用Trizol法提取总RNA进行RT-PCR扩增后获得目的基因,并将其克隆于质粒pMD18-T载体后转入大肠杆菌Top10细胞中,然后分别克隆于原核表达载体pET-32a(+)和真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,再进行抗性筛选、酶切鉴定和序列测定.结果表明:得到含有目的基因的阳性克隆,成功构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因原核表达载体pET-ORF5及真核表达载体pcDNA-ORF5.     

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列，分别设计一对引物，应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段，进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定，同时对插入序列进行测序分析，表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％，pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建，为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF3蛋白的原核表达及抗体检测ELISA方法的建立

通过外源表达PCV2 ORF3蛋白,为ORF3蛋白的抗体制备和检测提供基础材料。根据PCV2的ORF3基因序列设计特异性引物,克隆ORF3全基因,构建重组原核表达质粒,转入大肠埃希菌进行表达,将纯化的蛋白包被ELISA板,建立ORF3抗体检测ELISA方法。结果表明,获得了重组pGEX-6p-1-ORF3原核表达质粒,最佳表达条件为37℃,225 r/min,IPTG 1.0 mmol/L诱导5 h;建立的ELISA检测方法可以检测PCV2阳性血清,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清无交叉反应。本试验为ORF3抗体制备提供了基础材料,也为PCV2抗体检测提供了可选择方法。     

猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从已构建好的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku,表达量20%左右。经Western-blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

PRRSV野毒株细胞嗜性改变的分子机制:GP2a-GP3蛋白的变异发挥关键作用

正猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,该病毒分为两个基因型,即以LV为代表的欧洲型(基因I型)和以VR2332为代表的美洲型(基因II型)。PRRSV全长约15 kb,包含编码非结构蛋白的ORF1a和ORF1b、编码次要结构蛋白的ORF2-4、编码主要结构蛋白的ORF5-7以及两端非翻译区5'UTR和3'UTR。PRRSV是一种有囊膜的病毒,具有比较严格的细胞嗜性。而特异性的受体可能与细胞嗜性密切相