正交设计优化黑褐苔草ISSR-PCR反应体系

采用正交设计对黑褐苔草（Carexa trofusca）ISSR-PCR反应的Mg²⁺、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板进行优化,以期建立最佳反应条件并筛选退火温度。结果表明：黑褐苔草20μLISSR-PCR最佳反应体系为：1.80μmol·L^-1 Mg²⁺、0.60 U Taq DNA聚合酶、0.125μmol·L^-1 dNTP、0.3μmol·L^-1 Primer和50ngDNA模板;引物UBC807适宜退火温度为55℃。该体系能在不同个体中扩增出清晰的、稳定性好的条带。     

海雀稗SRAP-PCR分子标记体系优化及引物筛选

以4个代表性海雀稗（Paspalum vaginatum）种质的叶片DNA为模板,采用L₉（3⁴）正交试验设计,对影响海雀稗SRAP-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行了优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增的影响,以确定适合海雀稗的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明：海雀稗SRAP-PCR最佳反应体系为10×PCR buffer 1 μL、模板DNA50 ng、Mg²⁺2.5 mmol·L^-1、dNTP150 μmol·L^-1、引物0.4 μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶1.0 U,总体积10 μL。利用该反应体系从100对引物中筛选出可扩增清晰条带的引物83对,在83对引物中选出多态性丰富的引物44对。SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选,为今后利用SRAP标记技术进行海雀稗遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种提供技术支持。     

正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以假俭草叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2 、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对假俭草SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA对扩增效果的影响,建立了假俭草的SRAP最佳反应体系.结果表明,假俭草SRAP-PCR最佳反应体系为:2 μL 10譖CR buffer、60 ng模板DNA、Mg2 1.50 mmol/L、dNTP 260 μmol/L、引物0.25 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20 μL.各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg2 浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小.运用该体系对4份假俭草种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从45个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合.这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行假俭草分子遗传学研究提供了科学依据.     

小叶锦鸡儿SSR-PCR体系优化及应用

为建立适宜小叶锦鸡儿（Caragana microphylla）SSR PCR的反应体系,利用正交试验设计L16(45),对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度进行五因素四水平优化筛选,确立最佳反应体系和扩增程序。即在25 μL反应体系中包括：40 ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,300 μmol/L dNTP,0.6 μmol/L引物,1 U Taq DNA聚合酶,1×Buffer。扩增反应程序为：94℃10 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10个循环,每循环的复性温度递减1℃;94℃ 45 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。应用该优化体系对小叶锦鸡儿种质资源及不同引物进行了检验及筛选。本研究表明,该体系的建立为今后利用SSR标记对小叶锦鸡儿属遗传多样性研究、遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究工作提供依据。     

野火球RAPD反应体系优化研究初报

为建立一个稳定的野火球RAPD反应体系,对RAPD反应条件中模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2 浓度和dNTP浓度等各项参数进行筛选比较,创建其最佳反应体系为;250μl反应体系中,模板DNA51ng,Taq DNA聚合酶0.5U.引物浓度0.32μmol/L,Mg2 浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.20mmol/L,10×PCR Buffer 1.0μl,ddH2O19μl.     

本氏针茅SRAP PCR反应体系的建立及引物筛选

以本氏针茅（Stipa bungeana）幼嫩叶片为材料,建立适合本氏针茅基因组DNA提取的改良CTAB法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对本氏针茅SRAP PCR反应体系中的5个主要因素（DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+和引物）进行优化,旨在建立适合本氏针茅SRAP分析的反应体系。结果表明,在20 μL总的反应体系中各组分的加入量分别为：DNA（20 ng·μL-1）3 μL、Taq DNA酶(5 U·μL-1)0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1)1.4 μL、引物（10 μmol·L-1）1.0 μL、Mg2+ (25 mmol·L-1)2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 8.9 μL。体系验证和引物筛选试验表明,该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立可为本氏针茅种质资源遗传多样性研究和黄土高原植被恢复及生态建设提供理论基础。     

早熟禾ISSR反应体系的优化

以早熟禾基因组DNA为模板.利用正交设计,对影响ISSR反应体系的主要因素(Mg2+、dNTP、Taq酶)从4个水平上进行筛选和优化,建立了适合早熟禾的最佳ISSR反应体系:25μl反应体系中1.25U Taq酶、1.5mmol/L Mg2+,10×PCR Buffer 2.5μl、0.4 mmol/L dNTP、1μl引物、1μl DNA模板.扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,56.4℃退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存.在此反应体系下,可以得到重复性好、稳定且多态性高的条带.     

红豆草ISSR体系优化及其在航天诱变种质鉴定中的应用

采用正交设计法优化适合于红豆草（Onobrychis viciaefolia）的ISSR体系,对影响ISSR PCR的多个因素,包括dNTP、引物浓度、Taq酶浓度、Mg2+浓度进行了4因素3水平的比较、优化,建立了红豆草的ISSR最佳反应体系。运用该体系进行引物及最佳退火温度的筛选,并应用ISSR分子标记技术初步分析红豆草航天搭载诱变效应。结果表明,红豆草ISSR PCR最佳反应体系为：2.5 μL 10×PCR buffer、50 ng模板DNA、dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶1.5 U、引物0.4 μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L,总体积为25 μL。试验从53个ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的12个引物,并依次筛选出各引物的退火温度。12个引物标记结果显示共获得多态性位点142个,多态性比率为73.6%。地面对照的多态位点比率(P)、Nei基因多样度(h)和Shannon多样性指数(I)均低于航天诱变种,太空环境能够诱导红豆草发生基因变异。航天诱变可作为红豆草种质资源创新和品种选育的方法之一。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

鸭茅SRAP反应体系的建立与优化

为了为鸭茅分子标记辅助育种提供理论依据,研究采用L16(45)正交试验设计,对相关序列扩增多态性(SRAP)-PCR反应体系中的4种主要参数(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物)进行了分析。结果表明:建立的鸭茅SRAP-PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、引物0.4μmol/L,总体积为25μL。最佳PCR循环条件为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,52℃复性1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存。     

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L^-1dNTP, 0.5 μmol·L^-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

百脉根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对百脉根ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化实验,通过不同反应体系扩增效果比较,最终确定在20uL体系中各反应物的最适含量为:40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/LdNTPs、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA聚合酶。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行百脉根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

山生柳SSR-PCR反应体系优化

本研究以祁连山4个海拔梯度的山生柳（Salix oritrepha）为材料,采用L9(34)正交试验设计和单因子试验,分析山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物SHUK123的适宜退火温度进行优化。结果表明,PCR反应体系的最佳条件:20 μL体系中2.0 mmol·L-1 Mg2+ 1 μL,0.10 mmol·L-1 dNTPs 1.5 μL,0.5 U Taq酶用量为1 μL,20 ng·μL-1 DNA模板1 μL, 0.5 μmol·L-1的上下游引物各2 μL,10× Taq Buffer 2 μL,ddH2O加至20 μL。扩增反应程序：94 ℃高温预变性时间3 min,94 ℃变性45 s,Tm(不同退火温度)退火时间45 s,72 ℃延伸30 s,循环数30个,最后72 ℃后延伸时间5 min,4 ℃保温。适宜退火温度为56 ℃。以上结果表明,此反应体系在山生柳PCR扩增中的稳定性和可重复性较好。     

槲树DNA SSR-PCR反应体系的正交优化

利用正交设计L16(45)对槲树(Quercus dentata Thunb.)基因组DNASSR-PCR反应体系的5个因素(Tap酶,Mg2+,,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了槲树模板DNASSR-PCR反应的最佳体系(20μL):60ng模板DNA,2mmol/LMg2+,0.075U/μLTaq酶,0.4mmol/L dNTP,引物浓度0.1μmol/L。对槲树DNASSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行了梯度试验,最佳退火温度为51.3℃。     

蜜蜂遗传多样性研究的RAPD-PCR反应体系的正交优化

利用正交设计L16（45）对蜜蜂基因组DNARAPD-PCR反应体系的5个因素（Tag酶,引物,Mg2＋,dNTP,模板）在4个水平上进行优化试验,筛选出各个反应因素的最佳水平,建立蜜蜂模板DNARAPD-PCR反应的最佳体系（25L）：10×PCRbuffer3.0L,Tag酶0.5U,引物浓度0.4mol/L,Mg2＋浓度3.0mmol/L,dNTP浓度0.5mmol/L,模板40ng。对蜜蜂DNARAPD-PCR最佳反应体系的退火温度进行了梯度试验,最佳退火温度为54℃。