蒺藜苜蓿MtCYP450基因的克隆及功能分析

分析了豆科模式植物蒺藜苜蓿中MtCYP450的表达特性和对胁迫处理的反应。该基因编码508个氨基酸,蛋白分子量为58.31kDa,等电点为6.85。序列比对发现MtCYP450与狭叶羽扇豆和大豆中的2个CYP450家族94亚家族蛋白同源性较高,因此,MtCYP450属于细胞色素P450的CYP94亚家族。荧光定量PCR结果显示MtCYP450在叶中表达最高,茎中次之,根中最少。在胁迫处理(200mM NaCl、5%PEG、100μM ABA和100μM MeJA)8~12h后,叶片中MtCYP450基因表达量显著上升,表明该基因受逆境和生长调节剂诱导表达。T2代超表达MtCYP450基因拟南芥在PEG和MeJA处理后MtCYP450表达量均上升;对异源超表达拟南芥的生长情况分析显示转基因拟南芥在NaCl(125mM)处理后根长是野生型的1.63倍,表明MtCYP450基因增强了拟南芥根系的抗盐性。因此,MtCYP450基因可能对植物抵抗非生物胁迫具有重要作用。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

河北地区紫花苜蓿品种的生产性能比较研究

2013~2016年通过田间试验,对国内外15个紫花苜蓿品种的产量性能进行比较分析,以期筛选出适宜河北地区种植的苜蓿品种。结果表明,不同年份的苜蓿年产量具有极显著差异(P0.01);15个苜蓿品种中4年平均年产量(干重)居前三位的是中苜3号、中苜2号和WL712HQ,分别为14423.1kg/hm2、13706.3kg/hm2、13144.3kg/hm2。4个茬次的干草产量存在显著差异(P0.05),第1茬的产量最高,约占年总产量的38%,第4茬产量最低,年产量最高的两个品种的第一茬产量也最高。第一茬与年产量之间的关联度最高。综合4年的结果,筛选出适宜河北地区种植的苜蓿品种为中苜3号和中苜2号,国外品种中WL712HQ、WL903HQ和MagnumVI表现良好。     

紫花苜蓿甘氨酸脱羧酶H-蛋白基因MsGDC-H1功能分析

光呼吸通过清除2-磷酸乙醇酸（2-PG）使氧合光合作用成为可能,该过程对C₃植物至关重要。H-蛋白是光呼吸过程中将甘氨酸转化为丝氨酸的甘氨酸脱羧酶（GDC）的关键组成蛋白之一。本研究克隆了紫花苜蓿MsGDC-H1,该基因编码166个氨基酸,具有1个硫辛酰基附着位点保守结构域和1个N6-硫辛酰赖氨酸保守位点。进化分析表明,MsGDC-H1蛋白与双子叶植物的甘氨酸脱羧酶H-蛋白（GDC-H）亲缘关系近。表达模式分析表明,MsGDC-H1在苜蓿叶中表达丰度高,且受光诱导。为了探究MsGDC-H1基因对拟南芥生长的影响,分别使用光诱导的茎叶特异性启动子ST-LS1和组成型启动子CaMV 35S驱动MsGDC-H1（ST-LS1：：MsGDC-H1; CaMV 35S：：MsGDC-H1）在拟南芥中异源表达。检测过表达植株生物量、淀粉、可溶性糖含量以及光合速率。数据分析显示,CaMV 35S：：MsGDC-H1过表达拟南芥（G系列植株）生长受阻,淀粉含量比ST-LS1：：MsGDC-H1特异性表达拟南芥（GS系列植株）增加了34%~67%,比野生型（WT）增加了7.3%~33.7%;可溶性糖含量比GS系列降低了36%~38%,比WT增加了44.3%~49.7%;与WT相比,GS系列植株生长更快,淀粉含量无显著差异（P>0.05）,可溶性糖含量显著增加（P<0.05）。试验结果表明,MsGDC-H1基因在调控拟南芥光合速率、碳水化合物合成以及生长等方面发挥重要作用,未来可作为提高苜蓿产量的基因工程育种候选基因。     

紫花苜蓿LEA基因超表达载体的构建及烟草转化

运用已克隆的紫花苜蓿MsLEA3-1基因构建植物超表达载体,将MsLEA3-1插入带有启动子rolD和终止子nos的表达载体pKYLX7中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中。用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株卡那霉素抗性苗,对其中的4株进行PCR检测,全都扩增出目的条带;进一步对这4株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现4株系均有杂交带出现且均发生了基因转录,说明已成功获得能够表达MsLEA3-1基因的转基因烟草。     

3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因的克隆与分析

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的表达量最高;3个基因都能被多种非生物胁迫（盐、干旱、铝）和激素（脱落酸、赤霉素、乙烯利、水杨酸和茉莉酸甲酯）诱导,但表达模式不同。在盐浓度为200 mmol•L-1的筛选培养基上只有导入目的基因的愈伤组织能产生不定芽,250 mmol•L-1 NaCl处理再生植株10 d,转基因植株和野生型植株叶片的电导率和可溶性糖含量均呈现上升趋势,但野生型植株叶片的电导率显著高于转基因植株,可溶性糖含量则显著低于转基因植株（P＜0.05）;转基因植株和野生型植株叶片的叶绿素含量均呈现下降趋势,野生型植株叶片叶绿素含量显著低于转基因植株（P＜0.05）;盐胁迫条件下,转化不同基因的再生植株的电导率、叶绿素和可溶性糖含量没有显著差异（P＞0.05）。【结论】3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因都不包含内含子,其表达具有组织特异性,都能被多种非生物胁迫和激素诱导,能够使烟草愈伤组织在含盐培养基上形成不定芽并最终产生转基因植株,且转基因植株的耐盐性高于野生型植株。     

野牛草种子蛋白质双向电泳体系的优化

通过对野牛草种子蛋白双向电泳蛋白样品制备方法、等电聚焦程序以及固化胶条pH范围优化筛选,构建了适合其植物种子蛋白组研究的电泳体系。实验结果表明,使用Trizol法制备样品,可得到高纯度种子蛋白,结合使用pH4～7IPG胶条,以及优化的聚焦程序Ⅲ,能获得高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱。图像分析表明,银染后可以检测到600个以上蛋白点,其等电点主要分布于pH4～7区域,分子量主要分布于10～120kDa之间。     

紫花苜蓿MsZFN基因超表达载体的构建及对烟草的转化

对紫花苜蓿一种新的CCCH类型锌指蛋白基因进行克隆及转化到烟草中,为研究该基因的功能提供依据。将紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(EU624138)连接到载体pBI121上,构建成植物表达载体pBI-ZFN。将表达载体转化到感受态农杆菌株LBA4404中,利用农杆菌介导的方法,以烟草无菌苗叶片为外植体,转化烟草,经卡那霉素筛选获得十几个烟草再生植株。对其中四个再生植株进行PCR和Southern检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中,通过RT-PCR检测,初步证明目的基因在烟草中可以表达。     

农牧交错带退耕还草对耕作层土壤磷、钾含量的影响

在农牧交错带以小麦为对照,研究退耕还草对土壤磷、钾含量的影响。结果表明,退耕还草后,土壤0～20cm速效磷、钾含量均高于小麦地。冰草和无芒雀麦能较好地提高土壤速效磷和速效钾的含量。老芒麦与无芒雀麦混播(3:1)可以明显提高土壤速效磷含量。无芒雀麦与冰草混播(3:1)可以较好地提高土壤速效钾含量。     

我国苜蓿种子产业的思考与建议

<正>牧草种子产业是草业发展的基础,近十年来随着草业的迅速发展,特别是苜蓿种子产业在我国牧草种子中有了巨大的发展。有力地促进了我国草业的发展和农业产业结构的调整。原来盲目进口国外苜蓿草种的时代已经结束,国外大部分苜蓿品种正在退出我国草业市场,