蒺藜苜蓿MtCYP450基因的克隆及功能分析

分析了豆科模式植物蒺藜苜蓿中MtCYP450的表达特性和对胁迫处理的反应。该基因编码508个氨基酸,蛋白分子量为58.31kDa,等电点为6.85。序列比对发现MtCYP450与狭叶羽扇豆和大豆中的2个CYP450家族94亚家族蛋白同源性较高,因此,MtCYP450属于细胞色素P450的CYP94亚家族。荧光定量PCR结果显示MtCYP450在叶中表达最高,茎中次之,根中最少。在胁迫处理(200mM NaCl、5%PEG、100μM ABA和100μM MeJA)8~12h后,叶片中MtCYP450基因表达量显著上升,表明该基因受逆境和生长调节剂诱导表达。T2代超表达MtCYP450基因拟南芥在PEG和MeJA处理后MtCYP450表达量均上升;对异源超表达拟南芥的生长情况分析显示转基因拟南芥在NaCl(125mM)处理后根长是野生型的1.63倍,表明MtCYP450基因增强了拟南芥根系的抗盐性。因此,MtCYP450基因可能对植物抵抗非生物胁迫具有重要作用。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

代谢组学在牧草与草坪草抗逆性中的研究进展

牧草和草坪草的生长和发育常常面临着严重的盐碱、干旱、高温等非生物胁迫的影响。代谢组学是功能基因组学和系统生物学研究的重要技术，它涉及不同物种的细胞调控过程中代谢物的识别和定量，能够在代谢水平上有效地筛选与植物产量和抗逆性等相关的重要代谢物。目前随着色谱和质谱等技术的发展，牧草和草坪草对胁迫响应的代谢组研究也取得了许多重大进步。本文总结了近5年来代谢组学在牧草与草坪草抗逆性研究中的进展，详细描述和讨论了在水分、温度、盐分等非生物胁迫下草类植物中重要响应代谢物的鉴定以及不同代谢通路的调节与变化过程，以期为牧草和草坪草抗逆性研究及认识其内在逆境适应机制提供理论基础。     

两种白颖苔草对梯度NaCl胁迫的生理生化响应及综合评价

本试验以两个白颖苔草(Carex rigescens)品种‘绿坪1号’和‘绿坪2号’为材料,使用0,100,200和300 mmol·L^-1NaCl处理21 d,对处理后白颖苔草叶片进行了叶绿素含量、相对电导率、相对含水量、过氧化氢含量、丙二醛含量、钾钠比、净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度、蒸腾速率、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性指标的测定,并对各测定值进行隶属函数分析比较,探究两种白颖苔草在长期盐胁迫下的耐盐特性。结果表明：‘绿坪1号’中丙二醛含量和过氧化氢含量在盐浓度300 mmol·L^-1处理后比对照相比有更大幅度的上升;两材料中超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性变化不一致。随后经过相关性分析、主成分分析和隶属函数分析,提取3个主成分作为白颖苔草耐盐性评价的综合指标,经过计算得出耐盐性较强的是‘绿坪2号’。研究结果对白颖苔草在盐碱地利用及后续耐盐机理研究具有参考意义。     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子（NAC secondary wall thicking promoting factor）调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNST CDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素（GA3）,水杨酸（SA）和多效唑（PCB）诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST 的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成（60.83 %）;三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高（49%—55.9%）,并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平（12h）分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素（13%）、总糖（7%）和木质素（11.7%）含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因（PAL,4CL等）及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。     

蒺藜苜蓿叶绿素酸酯a加氧酶(MtCAO)基因的克隆与功能分析

叶绿素含量直接影响植物光合效率,从而决定其生物量。叶绿素酸酯a加氧酶(CAO)催化叶绿素酸酯a转化成叶绿素酸酯b,是叶绿素合成的限速酶之一。本研究克隆了蒺藜苜蓿MtCAO,该基因编码531个氨基酸。进化分析表明,MtCAO与双子叶植物的CAO亲缘关系较近。高等植物CAO基因的结构保守,均含有9个外显子。MtCAO主要在绿色组织尤其是叶片中高丰度表达。瞬时表达拟南芥原生质体试验显示,MtCAO-GFP融合蛋白定位于叶绿体。表达模式分析表明,茉莉酸甲酯(MeJA,100 μmol·L^-1)及黑暗处理抑制MtCAO的表达,而24 h内NaCl (100 mmol·L^-1)及聚乙二醇(PEG,5%) 处理先诱导后抑制其表达,且该基因受昼夜节律调控。这与对MtCAO启动子区顺式作用元件的预测结果一致。类似于超表达AtCAO的拟南芥,超表达MtCAO的拟南芥株系叶色正常,叶绿素含量及鲜重与野生型差异不显著,推测是由于MtCAO高度保守的A结构域中的降解子导致的。     

野牛草种质资源评价与分析

本研究对29份野牛草(Buchloe dactyloides(Nutt.) Engelm.)种质资源的7个形态特征指标和7个坪用特性指标进行多样性研究分析。结果表明，形态特征和坪用特征普遍存在变异，形态指标变异幅度为8.70%~23.44%，坪用特性指标变异幅度为1.88%~25.27%。形态特征与坪用特性之间存在相关性。主成分分析表明，叶长、株高、匍匐茎节间长、茎节数、密度、颜色、绿期等因子载荷较大，综合评价BD003，BD007，BD0013，BD019，BD022，BD026，BD027，BD029这8份材料整体表现优良。根据不同利用目标分别进行聚类分析，可依据扩展性分为3个类群，其中，第Ⅱ类群扩展性最强；依据观赏用指标聚类分为3个类群，第Ⅰ类群属植株低矮型，第Ⅱ类群属植株高大型。本研究结果可为野牛草的品种应用和选育提供理论参考。     

草坪草再生体系研究进展

草种是草坪业的基础，但我国缺乏自己培育的草坪草品种，所用草坪草种主要依赖于进口，因此草坪草育种工作亟待加强。常规育种周期长、效率低且难以实现精准靶向育种，而现代生物技术为草坪草育种提供了新的有效途径，其中构建草坪草高效再生体系，加快繁殖速度，对拥有再生体系的草坪草种进行遗传转化是其关键。本文主要综述了近年来对部分冷季型和暖季型草坪草的再生体系研究，总结了影响再生过程的关键因素、存在问题等，同时对未来草坪草再生领域的发展进行了展望，以期对今后草坪草新品种的研发、推广和应用提供参考。