枇杷iPBS分子标记的PCR体系优化与引物筛选

枇杷的DNA为模板进行iPBS-PCR扩增，采用预实验中效果较好的iPBS分子标记引物2241，对枇杷iPBS-PCR反应体系中的dNTP、Mg2+、引物、模板用量进行优化，根据检测结果确定枇杷iPBS-PCR使用：10×Taq buffer 2μL，25mM Mg2+ 1.6μL，2.5mM dNTP 1.6μL，10μmol/L Primer 1μL，5U/μL Taq酶0.2μL，模板DNA 5ng 的20μL反应体系。反应程序中的退火温度可以参考iPBS引物理论Tm值。对33条iPBS引物扩增测试的结果显示在该反应体系下可以筛选到22谱带清晰、多态性好的引物，可用于枇杷的分子标记分析。     

澳洲坚果RAPD标记反应体系的建立及应用

以澳洲坚果为试材,利用单因素试验对影响RAPD标记反应体系的主要因素进行优化,建立适合澳洲坚果RAPD标记的反应体系。结果表明,澳洲坚果RAPD最优反应体系为：20 μL反应体系中,含40 mg L_-1模板DNA,0.6 μmol L_-1引物,1.0 U Taq聚合酶,2.5 mmol L_-1 Mg₂₊和0.4 mmol L_-1 dNTPs。利用该最优反应体系对不同引物和澳洲坚果种质进行验证,扩增条带具有良好的可靠性和稳定性,且分辨率较高。因此,该RAPD-PCR反应体系可用于澳洲坚果种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

河北省野生苔草属植物ISSR分子标记开发及亲缘关系分析

为研究野生苔草属植物的亲缘关系，本研究以河北省33种野生苔草属植物及国外引种的20份苔草属种质为试验材料，采用单因素试验和正交试验，建立并优化了ISSR标记体系，并筛选出12条引物用于研究它们的亲缘关系及遗传多样性。结果表明：在25μL的反应体系中，DNA模板80 ng,引物浓度为5μmol·L^-1,Master Mix用量11μL,循环数48个为最佳配比。筛选出的12条ISSR引物共扩增出197个条带，多态性位点百分率为100%,可将33种河北省野生苔草属植物完全区分，但国外种质无法完全区分。在遗传距离为0.768时，53份苔草属种质可划分为6类，聚类结果与形态学分类的结果基本吻合，种间亲缘关系与地理环境有一定的相关性，以期为河北省野生苔草属的分类鉴定和指纹图谱构建提供一定理论依据。     

云南猪屎豆属遗传多样性的ISSR分析

以云南41份野生猪屎豆属种质为材料,用ISSR进行分析,结果表明, 100个ISSR引物中共筛选出16个多态性明显、反应稳定的引物, 41份材料DNA共扩增出164条条带,平均每个引物的扩增条带数为10.3条,其中多态性条带总数为159条,多态性比率为99.3%。材料间遗传相似系数范围在0.481 7~1.000 0,表现出丰富的遗传多样性;通过正交设计优化,得出适合猪屎豆属野生植物的ISSR-PCR反应体系为:40 ng模板DNA、引物0.2 μmol/L、200 μmol/L dNTP、1×Buffer (Mg²⁺ plus)、0.5 U Taq酶(TaKaRa);ISSR引物最佳退火温度为50或53℃;通过聚类分析,可将41份猪屎豆属种质分为5大类,同一种的种质可以很好的聚成一类;通过对思茅猪屎豆ISSR鉴定,得出它与猪屎豆属的遗传相似系数接近,然而确定该物种属于猪屎豆属需要做更多的鉴定。     

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L^-1dNTP, 0.5 μmol·L^-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

蛋黄果SCoT-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化蛋黄果SCoT-PCR反应体系,本研究先以蛋黄果“仙桃1号”为试材,SCoT1为引物,采用L16(45)正交试验,对影响蛋黄果SCoT-PCR反应的DNA、Mg2+、dNTPs、引物以及Taq聚合酶等因素进行优化。正交试验结果表明,不同因素对蛋黄果SCoT-PCR反应体系的影响存在差异,但不显著,其中最大的影响因素是Taq 聚合酶的含量,其次是dNTPs、模板DNA、引物和Mg2+的浓度。最终确立20μL的蛋黄果SCoT-PCR最佳反应体为：模板DNA 80 ng,Mg2+浓度3 mmol·L-1,dNTPs 浓度0.25 mmol·L-1,引物浓度0.4 μmol·L-1,Taq聚合酶含量 2 U。选用3份地理位置相距较远的蛋黄果种质为模板,对优化的反应体系进行验证,结果表明,在该体系下,3份种质均能稳定扩增出清晰明亮、数目丰富且稳定性高的条带,说明优化的蛋黄果SCoT-PCR反应体系适用于蛋黄果SCoT分子标记。     

樱桃属(Cerasus)REMAP标记的建立及贵州种质的亲缘关系分析

为丰富樱桃属分子标记，我们利用樱桃LTR引物和ISSR引物，筛选REMAP引物组合，建立了适合樱桃的REMAP标记的技术体系，并利用该标记对40个贵州地方樱桃种质亲缘关系进行分析。结果显示，适宜樱桃REMAP-PCR体系为： 总体系25 μL，MgCl2 2.0 mmol·L-1、 Taq酶0.75 U 、引物0.4 mmol·L-1 、模板DNA10 ng、dNPT 0.4 mmol·L-1，8%非变性PAGE对PCR扩增产物检测效果最好。利用上述体系筛选出10对REMAP引物组合，扩增出234个位点，平均多态性比率是92.29%。聚类分析显示，以相似性系数0.69为阈值，可以将供试材料分为3类：33种贵州地方栽培品种聚为一类，玛瑙红樱桃与4种野樱桃聚在一类，“红皮”樱桃与“青皮”樱桃聚在一类。     

中国芒属植物ISSR-PCR扩增反应体系的优化

芒属植物(Miscanthus)被认为适合作为新一代能源作物开发利用而成为当前国内外研究热点之一.为给后续相关研究奠定基础,本研究从中国芒属植物的芒(Miscanthus sinensis)、五节芒(M.floridulus)、荻(M.sacchari florus)、南荻(M.lutarioriparius)、尼泊尔芒(M.nepalensis)、双药芒(M.nudipes)和红山茅(M.paniculatus)等类群中挑取部分材料,以其基因组DNA为模板,采用同一试验考察多个因素及水平的筛选方式对ISSR-PCR扩增体系中的Mg2+、dNTP、引物、模板的浓度以及循环数进行优化,建立适用于中国芒属植物的最佳ISSR-PCR反应体系.该体系为20 μL,含Mg2+2.5 mmol·L-1,dNTP 0.25 mmol·L-1,引物0.5 μmol·L-1,DNA 2 μL及1 UTaq Plus DNA聚合酶和1×PCR buffer.结果将为进一步开展中国芒属植物的相关遗传分析研究提供技术参考.     

番石榴ISSR-PCR最适反应体系的建立与验证

为更好的将ISSR标记应用于番石榴种质研究，本研究以“维邦2号”番石榴DNA为筛选体系试验材料，采用单因子试验对ISSR反应中Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度、DNA浓度进行了优化。实验结果表明，番石榴20µl最适反应体系为：2.0µl 10×Buffer，1.0mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTPs，0.8mmol/L引物，0.2U Taq酶，10ng的DNA。利用该反应体系，选用引物UBC810对9份番石榴种质进行PCR反应，再选取“南宁本地番石榴实生2号”DNA作为模板对8条ISSR引物进行PCR反应，对所确立的扩增体系进行验证。结果显示扩增产物条带多态性丰富，且特异性强、重复性好，表明本研究所确定的反应体系适用于番石榴的ISSR分子标记。     

结缕草属植物SRAP－PCR体系的建立和优化

以ＳＤＳ法提取的结缕草属植物叶片ＤＮＡ 为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验２种方法,对影响结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的MG²⁺ 、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶和模板ＤＮＡ 五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用Ｌ１６（４５）方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据４对引物对６ 份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,２种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析２种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的最佳反应体系：MG²⁺２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ、２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ,总体积为２０μＬ。这一优化体系的建立为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。