白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

燕麦ISSR反应体系的建立与优化

以10个燕麦品种的基因组DNA为模板,从退火温度、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物5个方面对ISSR分子标记体系进行摸索并设计优化试验,建立了一套燕麦ISSR优化反应体系,即:25μl反应体系中,18.3μlddH2O,2.5μl 10×buffer,2.0μmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,1.5 U Taq DNA聚合酶,0.3μmol/L引物,10ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。     

紫花苜蓿耐盐测序扩增区段标记条件优化

以中苜一号紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhang mu No.1)为材料,对SCAR反应中的引物浓度、退火温度、Mg²⁺、dNTP浓度、模板DNA用量及Taq酶用量进行优化。结果表明:在3对SCAR中有2对引物出现目标扩增带,其中以SCAR1的效果最好;适宜反应体系总体积为25μL、Mg²⁺浓度2.5mM、dNTP浓度200μM、引物浓度0.5μM、Taq酶1.5U、模板DNA为50~100ng;优化后的反应体系能得到清晰稳定的SCAR扩增条带,可用于苜蓿耐盐性分子标记鉴定分析。     

鸭茅SRAP反应体系的建立与优化

为了为鸭茅分子标记辅助育种提供理论依据,研究采用L16(45)正交试验设计,对相关序列扩增多态性(SRAP)-PCR反应体系中的4种主要参数(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物)进行了分析。结果表明:建立的鸭茅SRAP-PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、引物0.4μmol/L,总体积为25μL。最佳PCR循环条件为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,52℃复性1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存。     

野火球RAPD反应体系优化研究初报

为建立一个稳定的野火球RAPD反应体系,对RAPD反应条件中模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2 浓度和dNTP浓度等各项参数进行筛选比较,创建其最佳反应体系为;250μl反应体系中,模板DNA51ng,Taq DNA聚合酶0.5U.引物浓度0.32μmol/L,Mg2 浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.20mmol/L,10×PCR Buffer 1.0μl,ddH2O19μl.     

黑琴鸡SSR-PCR反应体系的建立及优化

为了优化黑琴鸡简单重复序列(SSR)-PCR反应体系,试验以黑琴鸡基因组DNA为模板,采用L25(54)正交试验设计,对SSR反应体系中的4种关键因素(Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、DNA模板)进行优化。结果表明:各因素水平变化对PCR反应影响的显著性依次为引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA模板,试验建立的黑琴鸡SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为1 U Taq DNA聚合酶0.5μL,1.6 mmol/L dNTP 2μL,1.8μmol/L引物2μL,DNA模板40 ng,10×Buffer 2μL,加双蒸水至总体积为20μL。     

珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+, dNTPs,引物, Taq DNA 聚合酶及DNA 模板浓度进行优化。结果表明，适于杨桃研究的SCoT-PCR最佳反应体系为：总体积为20μL的反应体系中，含2.5mmol/L Mg2+，0.3mmol/L dNTPs，30mg/L模板DNA，1.00μmol/L引物和0.4U Taq DNA聚合酶。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证，扩增条带清晰，结果稳定可靠，证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

桑天牛遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立

建立适合的AFLP反应体系研究桑树主要害虫桑天牛(Apriona germari)的遗传多样性,有助于从分子水平分析桑天牛不同地理种群的遗传多样性以及开辟害虫防治新途径。对提取的桑天牛成虫基因组DNA预扩增中的Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量以及选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度和Taq酶的用量等进行单因素试验,优化反应体系。确定预扩增反应体系中的Mg2+终浓度为1.50mmol/L,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为10.0×10-7mol/L,Taq酶用量为1.00U;确定选择性扩增反应体系中的预扩增产物稀释倍数为40倍,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为5.00×10-7mol/L,Mg2+终浓度为1.50mmol/L,Taq酶用量为1.00U。用优化后的反应体系扩增得到了条带清晰的桑天牛AFLP图谱。     

正交设计优化崇明白山羊SSR-PCR反应体系

以崇明白山羊基因组DNA为模板,利用正交试验设计L16(45),对影响崇明白山羊SSR-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP及引物的浓度)进行优化。结合单因素完全随机试验筛选各因素的最佳水平,针对MCB3224引物建立了崇明白山羊SSR-PCR的最佳反应体系。结果表明:在20μL的反应体系中,5个因素的最佳水平分别为Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+2.5 mmol/L、模板DNA 30 ng、dNTP 0.20 mmol/L,引物0.8 mol/L;引物的最佳退火温度为57.3℃。利用16份崇明白山羊的DNA模板和2个微卫星引物验证此反应体系,聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示该体系稳定可靠且普适性较好。     

早熟禾ISSR反应体系的优化

以早熟禾基因组DNA为模板.利用正交设计,对影响ISSR反应体系的主要因素(Mg2+、dNTP、Taq酶)从4个水平上进行筛选和优化,建立了适合早熟禾的最佳ISSR反应体系:25μl反应体系中1.25U Taq酶、1.5mmol/L Mg2+,10×PCR Buffer 2.5μl、0.4 mmol/L dNTP、1μl引物、1μl DNA模板.扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,56.4℃退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存.在此反应体系下,可以得到重复性好、稳定且多态性高的条带.     

正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以假俭草叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2 、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对假俭草SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA对扩增效果的影响,建立了假俭草的SRAP最佳反应体系.结果表明,假俭草SRAP-PCR最佳反应体系为:2 μL 10譖CR buffer、60 ng模板DNA、Mg2 1.50 mmol/L、dNTP 260 μmol/L、引物0.25 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20 μL.各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg2 浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小.运用该体系对4份假俭草种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从45个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合.这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行假俭草分子遗传学研究提供了科学依据.     

红三叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验设计,对影响红三叶ISSR-PCR反应较大的4个因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP及引物)在4个水平上进行筛选,建立并优化了适合红三叶ISSR分析的最佳反应体系。在25μL反应体系中各反应物的最适含量为40ng模板DNA,10×PCR-buffer 2.5μL,2.5 mmol/L Mg2+,2.5UTaq DNA聚合酶,引物1μmol/L,0.2mmol/L dNTP。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,引物退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存。优化体系的建立为采用ISSR分子标记技术进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。     

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL),2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTP(2.5mmol/L),1.5μL引物(10pmol/μL),50ng模板DNA,ddH2O补足体积。以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃。12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81%。     

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2 和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选.结果确定了星星草ISSR PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存.20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2 2.0mmol/L.     

番石榴ISSR-PCR最适反应体系的建立与验证

为更好的将ISSR标记应用于番石榴种质研究，本研究以“维邦2号”番石榴DNA为筛选体系试验材料，采用单因子试验对ISSR反应中Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度、DNA浓度进行了优化。实验结果表明，番石榴20µl最适反应体系为：2.0µl 10×Buffer，1.0mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTPs，0.8mmol/L引物，0.2U Taq酶，10ng的DNA。利用该反应体系，选用引物UBC810对9份番石榴种质进行PCR反应，再选取“南宁本地番石榴实生2号”DNA作为模板对8条ISSR引物进行PCR反应，对所确立的扩增体系进行验证。结果显示扩增产物条带多态性丰富，且特异性强、重复性好，表明本研究所确定的反应体系适用于番石榴的ISSR分子标记。     

鸭茅ISSR反应体系的建立及引物筛选

以鸭茅基因组DNA为模板，对ISSR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化实验，建立了一套鸭茅ISSR分子标记的最优化反应体系，同时筛选出了12个适于鸭茅基因组DNA且PCR扩增效果较好的ISSR引物。鸭茅ISSR分子标记的20μL最优化反应体系中，最终浓度：Mg^2＋为1．6mmol／L、dNTP为250mol／L、Taq酶为1．0 U、引物浓度为0．25μmol／L、模板DNA量为100ng。     

航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化以及引物的筛选

航天育种的变异频率高、变异幅度大、有益变异多、稳定性强,优势明显。依据正交试验设计原理,设计了用正交试验和细调正交试验来确定航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg2+4种因素对航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系进行了优化,得到适合航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR最佳反应体系,即25μL的反应体系中含有dNTP 0.2 mmol/L、TaqDNA聚合酶2U、引物0.7μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、以及10×buffer和60 ng模板DNA。在试验确定最佳反应体系基础上,对17对SSR引物进行筛选,选出6对扩增条带信号强、背景清晰的引物。     

小叶锦鸡儿SSR-PCR体系优化及应用

为建立适宜小叶锦鸡儿（Caragana microphylla）SSR PCR的反应体系,利用正交试验设计L16(45),对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度进行五因素四水平优化筛选,确立最佳反应体系和扩增程序。即在25 μL反应体系中包括：40 ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,300 μmol/L dNTP,0.6 μmol/L引物,1 U Taq DNA聚合酶,1×Buffer。扩增反应程序为：94℃10 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10个循环,每循环的复性温度递减1℃;94℃ 45 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。应用该优化体系对小叶锦鸡儿种质资源及不同引物进行了检验及筛选。本研究表明,该体系的建立为今后利用SSR标记对小叶锦鸡儿属遗传多样性研究、遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究工作提供依据。     

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以内蒙古呼和浩特市近郊野生马蔺DNA为模板,采用均匀设计,通过5因素5水平和5因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度等)进行优化筛选,建立了适合马蔺的最佳ISSR-PCR反映体系:在25μl反应体系中,包括2.5μl 10×PCR Buffer、2.0mmol/L Mg2+、2.5μmol/L dNTP、1μmol/L引物1、.5U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA。在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性3min;然后进行40个循环(94℃变性45s,52.3～60.5℃退火30s,72℃延伸1.5 min);循环结束后,72℃延伸5min。