实时荧光PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的研究

目的建立快速检测水产品中副溶血性弧茵的实时荧光PCR方法。方法利用副溶血性孤菌TDH基因的保守序列设计引物和探针,建立快速检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法。结果本研究建立的检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法,其纯茵检测低限低于10cfu/PCR反应体系;对模拟阳性样品直接检测,检测低限为10~3cfu/g。模拟样品经增茵培养4～6h后,检测低限达1cfu/g;用本法对24株标准菌株/参考菌株进行检测,结果除副溶血性弧菌呈阳性外,其他23株非副溶血性弧菌均呈阴性反应;重复性试验结果:批内和批间变异系数均小于1%。结论本研究建立的副溶血性弧菌实时荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异和重复性好的优点,可在8h内对水产品中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测。     

沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7双重荧光PCR检测方法的研究

目的建立一种能同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的快速检验。方法根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应条件,建立可同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的检验,并与miniVIDAS快速初筛方法和SN标准方法进行比较。结果本研究建立的双重荧光PCR方法可同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7,对纯菌的检测灵敏度均低于10CFU/双重荧光PCR反应体系。应用本方法检测36株标准/参考菌株,结果只有9株目的菌标准/参考菌株出现特异性扩增,其余27株非目的菌均呈阴性反应。定量检测重复性试验结果,批内和批间的变异系数均小于2%。应用本方法检测人工染菌样品,结果与miniVIDAS和SN方法检测结果一致,但检测时间比miniVIDAS快了3倍,比SN标准快了10多倍。结论本研究建立的双重荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点,可在8小时内完成样品沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的检验。     

多重荧光PCR检测水产品致病菌方法的建立与应用研究

根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157：H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯茵的检测灵敏度均低于1O cfu／PCR反应体系。人工染菌样品经6h增菌,检测的灵敏度可低于10c...     

肽核酸荧光原位杂交技术检测生肉中沙门氏菌方法的建立及应用

本研究设计了一种基于沙门氏菌毒力基因侵袭蛋白A(invA)的特异性肽核酸(PNA)探针,在前期优化条件的基础上,建立并评估了沙门氏菌肽核酸荧光原位杂交(PNA-FISH)的检测方法。特异性试验结果显示,该方法的Sal-invA探针除对目标菌杂交呈阳性外,与12株常见的非目标菌杂交均为阴性,特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对沙门氏菌的检测限为10~5cfu/mL,而荧光定量PCR方法和细菌分离培养法对沙门氏菌的最低检测限分别为10~2cfu/mL和10~5cfu/mL,PNA-FISH方法的灵敏度与分离培养方法相近。人工污染沙门氏菌的生肉制品,增菌培养后经上述3种方法检测的最低检测限均可达到100cfu/mL。对83份生鲜肉经增菌培养后,用上述3种方法检测。结果显示,该方法与细菌分离培养方法和荧光定量PCR方法的符合率均达到98.8%。表明,增菌培养是提高该PNA-FISH检测方法灵敏性的重要步骤。本研究建立的检测沙门氏菌的PNA-FISH方法快速、准确、灵敏,适合用于临床肉制品的检测。     

Percoll分离法与多重PCR快速检测肉品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌

为从食品中有效分离致病菌,去除PCR反应的抑制因子,提高多重PCR检测灵敏度,本研究利用Percoll密度梯度离心的前处理法从鲜肉样品中高效分离沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌,以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因,经过PCR分别扩增出255 bp、506 bp、620 bp的DNA片段,DNA测序证实这些片段为目的扩增产物。该体系检测猪肉匀浆液中3种致病菌的灵敏度为6.2×103 cfu/mL、1.2×103 cfu/mL和2.4×103 cfu/mL,检测时间约6 h。Percoll前处理法与多重PCR检测肉中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为同时检测肉类样品中多种致病菌提供了有效的检测方法。     

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化

为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件,本研究在前期建立的TaqMan荧光定量PCR方法的基础上,设计一条特异性的反转录引物,优化反应体系,建立了简便、快速、敏感的TaqMan荧光定量PCR方法。该荧光定量PCR方法最低检测限为10拷贝,敏感性是未优化的荧光定量PCR方法的5倍、是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检测限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs,证明了该方法特异性好。对现地60份疑似DTMUV的样品进行检测,用该方法检出57份样品为阳性,明显高于普通PCR,并且在区分35Ct值左右样品试验中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUV TaqMan荧光定量PCR方法更适用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。     

副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。     

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LM iap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

羊鞭虫病实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测羊鞭虫病实时荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的羊鞭虫(Trichuris ovis)ITS基因序列(登录号:JF680987.1),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,建立检测羊鞭虫病的TaqMan实时荧光PCR方法。对反应体系的特异性、敏感性和稳定性进行评价,并用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R^2=0.994,扩增效率E=1.05。该方法特异性强,与其他8种常见家畜寄生性线虫病不发生交叉反应;灵敏度高,最低检出下限为31.7拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数分别为0.43%~1.04%和1.20%~1.91%,均小于2.00%。用建立的实时荧光PCR方法和显微镜检查方法分别对20份临床样品进行检测,实时荧光PCR和显微镜检查方法检出的阳性样品分别为14和9份。本研究建立的TaqMan实时荧光PCR方法能在粪便中快速、准确、灵敏检测羊鞭虫卵,为羊鞭虫病的检测和防控提供新的方法。     

猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2％.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具.     

大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种可以同时扩增大肠杆菌(E.coli)F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因保守序列的多重PCR检测方法,本研究设计合成5对分别针对F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的特异性引物,以具有相应菌毛基因的E.coli参考菌株DNA为模板,通过对多重PCR反应条件的优化,建立了检测F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR方法能够特异性扩增F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的目的片段,大小分别为770 bp、533 bp、422 bp、643 bp和1140 bp,该方法对沙门氏菌、猪丹毒杆菌、巴氏杆菌以及无菌毛基因的E.coli等参考菌株均无特异性扩增片段,检出F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最低活菌浓度分别为5.3×10^5cfu/mL、3.7×10^6cfu/mL、3.1×10^5cfu/mL、3.7×10^7cfu/mL、6.9×10^5cfu/mL。用不同批次的引物和试剂进行3次多重PCR检测均能扩增出目的条带,表明建立的多重PCR方法有很好的批内和批间重复性。对90株大肠杆菌临床分离菌株菌毛基因进行检测,F4阳性率为3.33%,F5阳性率为2.22%,未检测到F6、F41和F18阳性菌株,其检测结果与常规单一PCR的检测结果一致。研究表明:建立的E.coli菌毛基因多重PCR分型方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,可用于E.coli分离菌株菌毛基因型的快速鉴定,同时提高了检测效率。     

环介导恒温扩增(LAMP)-检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu/mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

环介导恒温扩增（LAMP）——检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu／mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

副溶血弧菌和溶藻弧菌双重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时快速检测海产品中的副溶血弧菌(VP)和溶藻弧菌(VA)的双重PCR方法,本研究根据VP和VA的toxR基因序列设计针对这两种细菌的两对特异性引物,建立能够快速同时检测这两种细菌的双重PCR方法,并对该反应体系的特异性和灵敏度进行检测。结果显示纯培养细菌VP和VA的检测灵敏度分别为2.32×103cfu/mL和2.56×103cfu/mL,临床病料检测灵敏度分别为2 cfu和3 cfu;与枸橼酸杆菌、沙门氏菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌无交叉反应。研究表明本实验方法操作简便快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,并且经济实惠,值得推广应用。     

Ring-trial results for the cultural detection of Salmonella in poultry faeces

The Directive 2003/99/EG of the European Parliament and of the Council on the monitoring of zoonoses and zoonotic agents demands a quality management (QM) system for the execution of its monitoring programmes. Consequently the National Salmonella Reference Laboratory of Germany performed two ring-trials in 2005 and 2006 on the microbiological detection of Salmonella from poultry feces among all participating laboratories in the Federal States. Salmonella detection was performed according to the EN ISO 6579:2002 standard method which was modified according to the recommendations of the Community Reference Laboratory for Salmonella in Bilthoven, The Netherlands. This method uses modified-semisolid Rappaport-Vassiliadis Agar as the only selective enrichment. In 2005 twenty-four and in 2006 twenty-two laboratories participated.They received eight identical samples of the contamination levels L0 (no Salmonella), L1 (11 and 16 cfu per 10 g faeces respectively) and L2 (292 and 418 cfu per 10 g faeces respectively). For both years the data of 20 laboratories could statistically be evaluated. The relative accuracy of the respected results increased from 88.8% in 2005 to 98% in 2006. This is as well reflected in the improved COR- and Kappa-Indices. Taken all together the data show, that the modified-semisolid Rappaport-Vassiliadis protocol is a sensitive, established method for the detection of Salmonella from poultry faeces.     

Comparison of DNA isolation methods and detection of Salmonella spp. from animal faeces and dust using invA real-time PCR

There is a strong interest to reduce the expenditure for the detection of Salmonella spp. from animal faeces and environmental samples from primary production according to ISO 6579:2002 Annex D by including a rapid and effective method to detect Salmonella spp. already after pre-enrichment in BPW. It has been shown that real-time PCR methods are very effective to detect Salmonella organisms after pre-enrichment of foods. However, materials from primary animal production compose of much higher amounts of substances which might inhibit the sensitivity of real-time PCR. Different techniques of DNA isolation after pre-enrichment of artificially inoculated bovine faecal material were used to compare their detection limit and detection probability using an invA 5' nuclease real-time PCR approach. A detection probability of 100% was shown at 10(5) cfu/ml using the QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germany), at 10(4) cfu/ml using the High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Germany) and at 10(3) cfu/ml using thermal cell lysis or an in-house lab protocol, respectively. In comparison DNA isolation by thermal cell lysis revealed a very good detection limit, low costs and almost no risks of contamination. Furthermore, caecal contents from pigs were analysed by ISO 6579:2002 Annex D and the invA real-time PCR using thermal cell lysis for DNA extraction. As a result neither false positive nor false negative findings were obtained. Inclusion of the real-time PCR after pre-enrichment of samples in BPW followed by bacterial detection of Salmonella only with samples positive with real-time PCR might be a valuable tool to fulfil the international standard of ISO 6579:2002 Annex D but also to diminish the expenditures. However, it must be stated that the modification of an international standard method and its use in routine diagnostic requires the validation and registration of national and/or international competent authorities.     

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。     

减毒沙门氏菌为载体的口服生长抑素DNA疫苗对草鱼的安全性

幼草鱼灌服10^8、10^9、10^10cfu／mL减毒沙门氏菌为载体的口服生长抑素DNA疫苗ZJ111／pcDNA3-SS，另设野生型鼠伤寒沙门氏菌（10^9cfu／mL）和PBS对照组，试验期20d，观察并比较各组死亡率。另取150g左右的草鱼灌服PBS、10^8cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS和10^8cfu／mL野生型鼠伤寒沙门氏菌组，7d后屠宰取肝和脾脏，做透射电镜切片观察。结果显示，灌服10^9cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS的幼鱼在试验期间死亡2尾，灌服10^8cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS和PBS的幼鱼采食和生长正常，灌服野生型S．typhimurium和10^10cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS的幼鱼死亡率分别为76．67％、26．67％。灌服10^8cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS的草鱼肝、脾细胞形态正常，肝脏线粒体略微肿胀，内质网间距略有增大，但病变特征不明显；10^8cfu／mL的zJ111／pcDNA3-SS对草鱼具有相对安全性。     

李斯特菌套式PCR快速检测方法的建立及初步应用

根据GenBank数据库的单核细胞增生李斯特菌iap基因设计2对引物,建立了套式PCR快速检测单增李斯特菌的方法。两对引物分别扩增出约1 500 bp和500 bp片段,与预期大小一致。套式PCR方法灵敏性实验检测极限为10 cfu/mL;人工污染猪肉检测极限为103cfu/mL;整个检测过程可在7 h内完成。采用该法对南海口岸进口的冻肉进行检测,检测出9份阳性,与传统的细菌分离方法完全一致,说明套式PCR方法具有很好的特异性。