基于ORF3基因检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究参照已有的研究报告,对PEDV ORF3基因序列进一步比较优化,选择PEDV ORF3更为保守的序列设计引物,经PCR扩增目的片段后构建了PEDV ORF3基因的重组质粒标准品pMD18-T-ORF3,以其为模板,经反应条件优化,建立了基于PEDV ORF3基因的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.9982,Ct值与质粒标准品在102拷贝/μL～1010拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法除对PEDV检测结果为阳性外,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪圆环病毒3型和猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对重组质粒标准品的检测下限为102拷贝/μL,比普通RT-PCR灵敏100倍,敏感性高;批内和批间重复试验的变异系数均小于5%,重复性好。临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量RT-PCR检出阳性样品22份,而常规RT-PCR仅检出16份阳性样品,二者的符合率为82.86%。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快捷、特异、敏感检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物,经过对反应条件进行优化,建立了检测PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。该方法对常见的病毒均未检测到荧光信号,而仅对PEDV检测为阳性,其灵敏度为57拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对26份疑似PEDV感染的病料样品进行检测,结果显示本研究所建立的方法对PED的检出率比常规PCR高23.07%。本实验建立的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可以用于临床PEDV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一种特异、灵敏、量化且耗时短的检测方法,通过设计1对PRRSV ORF7基因的引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量PCR(real-time PCR)的检测方法,对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验,并检测PRRSV疑似感染的临床病料。结果显示,所建立的real-time PCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=0.999,具有良好的线性关系;与传染性胃肠炎病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)无交叉反应,特异性强;与常规RT-PCR检测方法相比,灵敏度提高100倍;重复试验表明变异系数系数在1%以下,重复性良好。对27份临床样品进行检测,结果比常规PCR多检出3份阳性。说明建立的real-time PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面均相比良好,可用于临床PRRSV的检测。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品。结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R~2=1.000,具有良好的线性关系;检测猪流行性腹泻腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无交叉反应,特异性强;相比常规RT-PCR检测方法,灵敏度高出100倍;重复试验的变异系数系数小于1.5%,重复性良好。对31份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出4份阳性样品。建立的RT-qPCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面均表现良好,可用于临床猪瘟病毒的检测。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪流行性腹泻病毒变异毒株快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒变异毒株S基因中298bp的保守序列,并克隆到pM D18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5.2×10~1拷贝,与猪流行性腹泻病毒经典毒株、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PEDV变异毒株的检测。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID₅₀/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速、准确、灵敏检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,以PEDV N基因为靶标设计引物,建立了一种PEDV SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可以检测到10个拷贝的病毒核酸,与猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒等胃肠道病毒均无交叉反应,批内、批间重复试验的变异系数均在2%以内,表明该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。运用该方法对2018—2019年采集自山东省不同地区猪场的161份临床样品进行检测,检测结果与RT-PCR方法完全一致。以上结果说明,本试验所建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法为PEDV的快速检测提供了良好工具和技术支持。     

PEDV和TGEV双重TaqMan荧光定量一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

本文通过对猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)基因组生物信息学分析,分别在两种病毒基因保守区设计特异性探针和Real-Time PCR引物,并建立了检测PEDV和TGEV的双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,本研究建立的方法对其他常见病毒无交叉检出,具有较强的特异性;应用本方法对PEDV和TGEV检测灵敏度均可达101个拷贝。应用本法组装PEDV和TGEV双重实时荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒批次内、批次间的变异系数CV(coefficient of variation,CV)分别低于0.58%和3.7%。应用该试剂盒对97份病例进行检测,阳性率提高了14.93%。本研究建立的一步法荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高、定量且重复性和稳定性好等优点,在PEDV和TGEV感染的快速鉴别诊断,以及流行病学调查方面都有广阔的应用前景。     

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。     

实时荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立及应用

本研究将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因部分片段克隆并连接到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒,以此为标准模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对20份临床疑似病料进行检测,发现14份为荧光定量RT-PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出10份。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL~(-1),其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00。应用该方法检测了2018—2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

TGEV-PEDV二重RT-PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立能同时检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的二重RT-PCR检测方法。首先根据Gen Bank收录的TGEV和PEDV的基因序列,设计扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的特异性引物,然后通过优化二重PCR的体系建立一个二重RT-PCR检测方法。用该方法对临床收集的10份粪便样品进行检测,初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特异性和灵敏度,能用于临床诊断及流行病学调查。     

基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种病毒中仅PEDV为阳性扩增结果,其余病毒为阴性结果,特异性较强;对PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10^1拷贝/μL,敏感性较高;组内、组间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法对采集的272份临床仔猪腹泻样品(粪便、小肠组织)进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品39份,阳性率为14.34%,与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%;本研究建立方法检测的阳性样品经PEDV N基因测序鉴定,确实均为PEDV阳性样品。本研究建立的基于DPO引物检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法为PEDV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立快速、简便且能同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验根据GenBank中已登录的PRRSV ORF7基因序列和PEDV N基因序列,设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化扩增条件建立检测PRRSV和PEDV的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,同时还进行了特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品检测。结果表明:最终确立的20μL扩增体系中各引物和探针的加样量分别为:PRRSV-F 0.8μL,PRRSV-R 0.6μL,PRRSV-P 0.5μL;PEDV-F 1.2μL,PEDV-R 1.0μL,PEDV-P 0.7μL。(优化后的最佳扩增程序为:50℃反转录6 min;95℃预变性1 min;95℃变性10 s,55℃退火10 s,72℃延伸10 s,共40个循环)。检测PRRSV和PEDV的敏感性可分别达到1.05 TCID_(50)/100μL和3.16 TCID_(50)/100μL,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,批内变异系数和批间变异系数均不高于2.0%。用该方法对234份临床样品进行检测,PRRSV阳性样品15份, PEDV阳性样品20份,检出率高于常规RT-PCR方法。说明试验建立的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,特异性好,可同时准确、快速检测PRRSV和PEDV。     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。     

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）与传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R_（P）²=0.9994和R_（T）²=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1 000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数（CV）均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%（6/114）和8.8%（10/114）,混合感染检出率为4.6%（5/114）,比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。