牛无浆体16S rRNA基因的克隆测序及分析

从自然感染无浆体的重庆黄牛无菌采集血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1500 bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,并与5条边缘无浆体、4条中央无浆体、4条牛无浆体、4条羊无浆体和3条嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析.结果表明所克隆的基因片段长度为1412 bp,GenBank登录号为FJ169957.序列比较结果显示,所获得的序列与Kawa-hara公布的牛无浆体日本株(AB211163)同源性最高,达到99.0%,系统发育分析发现,该序列被聚类到牛无浆体群,并与嗜吞噬细胞无浆体群聚类到一个大的分支.本文从分子水平证实重庆地区存在牛无浆体,牛无浆体与嗜吞噬细胞无浆体的亲缘关系比其他3种无浆体更近.     

湖南省牛无浆体虫株分子生物学鉴定

用原虫16 S rRNA基因序列通用引物对湖南5个地区牛无浆体感染的阳性血液样品进行PCR扩增,经测序和序列拼接,获得5个无浆体样品16 S rRNA基因的部分序列,应用分子生物学软件进行分析,并根据所获得序列的保守区间设计特异性引物,进行PCR诊断方法的探讨性研究.结果表明,在通用引物下,5个地区无浆体感染的阳性血液样品均获得1 425 bp大小的虫体16 S rRNA基因条带;测序后5个无浆体16 S rRNA序列同源性均在97%～98%.证明5个分离虫株初步鉴定为牛边缘无浆体.     

新疆南疆部分地方品种羊无浆体的分子检测与鉴定

为了解新疆南疆部分地方品种羊的无浆体感染情况和分子特征,用PCR法检测新疆南疆5种地方品种绵羊共100份血液DNA样本,发现无浆体总感染率为67.0%(67/100)。以多浪羊感染率最高,为100%(20/20),和田羊感染率最低,为44.0%(11/25);散养和圈养羊的无浆体感染率分别为74.0%(37/50)和60.0%(30/50)。67份无浆体阳性样本中,65份检出绵羊无浆体,14份检出嗜吞噬细胞无浆体,其中有12份样本中同时检出绵羊无浆体和嗜吞噬细胞无浆体,未检出牛无浆体和山羊无浆体。序列比对分析,绵羊无浆体存在3个基因型,分别为基因型AO1(n=40)、基因型AO2(n=12)和基因型AO3(n=13);嗜吞噬细胞无浆体存在3个基因型,分别为基因型AP1(n=12)、基因型AP2(n=1)和基因型AP3(n=1)。结果表明,新疆南疆部分地方品种羊的无浆体感染较普遍,应加强对其检测和防治。     

云南山羊感染嗜吞噬细胞无浆体调查分析

为了解云南山羊无浆体的感染及发病情况,2018—2019年从云南12个县20个山羊养殖场/户采集全血样品983份,进行原虫病原学调查及遗传进化分析。调查结果表明:云南山羊存在无浆体感染,但其感染率维持在较低水平,仅有石林县1个养殖场的3份样品为嗜细胞无浆体阳性,总血液样品阳性率为0.3%;通过16S rDNA测序比对验证,阳性感染场3份无浆体均为嗜细胞无浆体(登录号:MN922957),基于16S rDNA基因序列构建的遗传进化树表明,云南感染株SHILIN与嗜吞噬细胞无浆体新疆绵羊株KG782376核苷酸同源率为100%,与陕西株MG869254同源率为99.7%,与边缘无浆体同源率为96.9%。     

新疆北部地区蜱传嗜吞噬细胞无浆体病原学检测与分子遗传进化分析

为调查我国新疆北部地区蜱及牛、羊体内蜱传播性嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum)病原的流行情况,收集了新疆北部地区13个县(市)的蜱虫样品及血液样品(蜱虫样品609只,牛血液样品670份,羊血液样品631份),提取基因组DNA, PCR检测后挑选阳性样品测序(1/3),分析其感染状况及病原分子遗传特征。结果显示,蜱虫和血液样品中共检测出183份A.phagocytophilum感染阳性,牛、羊和蜱虫感染率分别为10.0%(67/670)、9.5%(60/631)和8.2%(50/609),样品总体感染率为9.3%(177/1 910)。此次获得的新疆北部地区A.phagocytophilum 16S rRNA和MSP4基因序列遗传进化分析显示,该区牛、羊和蜱体内检测到的病原基因阳性片段与GenBank已公布的中亚、中欧地区病原基因序列同源性为96.7%～99.5%,进化树分析显示与中亚、中欧多国A.phagocytophilum基因序列聚为一支。结果可为新疆北部地区蜱与蜱传播性嗜吞噬细胞无浆体病的防控提供理论依据。     

阿克苏地区牛感染嗜吞噬细胞无浆体病情况调查分析

为了解阿克苏地区牛嗜吞噬细胞无浆体病流行分布情况,笔者采用PCR方法对519份牛抗凝血和96只蜱虫样品进行了检测。结果显示,牛感染嗜吞噬细胞无浆体阳性率为17.0%,蜱感染嗜吞噬细胞无浆体阳性率为16.7%,差异无统计学意义(χ2=0.05,P>0.05)。调查结果表明,阿克苏地区是牛嗜吞噬细胞无浆体病流行地区。     

奶牛温氏附红细胞体16S rRNA基因的克隆及系统进化分析

无菌采集感染温氏附红细胞体(E.wenyoni)的牛血液,抽提E.wenyoni基因组DNA,参考GenBank发表的E.wenyoni 16S rRNA基因序列(AF016546),设计1对特异性引物,扩增并克隆E.wenyoni 16S rRNA部分基因,基因产物大小为1 005 bp.序列比较结果显示,所测序列与参考序列(AF016546)同源性最高.达97.9%.系统发育分析表明,所测序列与支原体属病原代表种的序列接近.同源性约为70%,而与无浆体科病原代表种的序列相差较远,同源性约为50%.可见,E.wenyoni应归为支原体属,而不应属于立克次氏体目、无浆体科.     

吉林省部分地区蜱和羊携带羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体分子流行病学调查

为调查吉林省部分地区蜱虫和羊体内羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的流行情况，本试验采用PCR方法对采自吉林省5个地区的340份羊血液样本和841份蜱虫样本进行检测，并对部分阳性样本测序，建立系统发育树。结果显示，蜱虫中羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别为4.64%(39/841)和7.13%(60/841);羊血液样本中羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别17.06%(58/340)和10.00%(34/340),混合感染率为3.24%(11/340)。蜱虫和羊血液样本中感染的羊泰勒虫为吕氏泰勒虫单独感染，未检测到尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。系统发育树分析显示，蜱虫和羊血液样本中检测到的泰勒虫与吕氏泰勒虫处于同一分支，与吕氏泰勒虫河南株亲缘关系较近，与尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫亲缘关系较远；蜱虫和羊血液样本中检测到的嗜吞噬细胞无浆体与韩国株、俄罗斯株处于同一分支，亲缘关系较近。结果表明，吉林省羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体感染普遍存在。本调查结果为吉林省羊泰勒虫病和嗜吞噬细胞无浆体病的综合防治提供了理论依据。     

环形泰勒虫与牛无浆体双重PCR方法的建立

旨在建立快速检测环形泰勒虫和牛无浆体的双重PCR方法,调查吐鲁番地区这2种病原感染情况。根据NCBI库中上传的环形泰勒虫Spm2、Tams1基因和牛无浆体16S rRNA基因保守序列设计、合成3对特异性引物,使用PCR扩增并测序。根据Spm2和16S rRNA基因设计双重PCR并对反应体系及条件进行优化,对该方法进行特异性、灵敏性和重复性检测,建立一种双重PCR方法。结果显示,双重PCR方法特异性扩增出环形泰勒虫和牛无浆体相应目的片段,片段大小分别为853,351 bp,而驽巴贝斯虫、马泰勒虫、绵羊无浆体和伊氏锥虫均未扩增出条带。对环形泰勒虫Spm2、Tams1和牛无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析,环形泰勒虫Spm2基因序列与印度株同源关系最近(MH844677)、Tams1基因序列与突尼斯株同源关系近(AF214899),牛无浆体16S rRNA基因序列与突尼斯株同源关系近(KY655808)。此方法能检测环形泰勒虫与牛无浆体最低浓度分别为2.9×10^-16,1.8×10^-19 g/μL。用该方法对临床60份牛血DNA进行双重...     

新疆南疆部分地区绵羊的绵羊无浆体病感染情况调查

为了解南疆地区绵羊感染绵羊无浆体感染状况,试验从南疆4个地区(喀什、和田、阿克苏、巴音郭楞蒙古自治州)的21个县市采取绵羊血液样品,进行流行病学调查。对采集的637份血液样品中绵羊无浆体的16S rRNA进行巣式PCR扩增,并分析584 bp片段的阳性样品。结果表明:巴州、喀什、和田和阿克苏地区的感染率分别为75.8%、34.8%、23.3%和23.0%,平均感染率为33.3%;采样点各县市中感染率最高的为巴楚县91.4%,最低为阿瓦提县感染率10.3%,各地区感染率差异性较大。调查说明,新疆南疆地区属于绵羊无浆体病高发地区,急需采取科学防控措施。     

青海省海北地区牦牛源贾第虫检测与基因型分析

为研究青海省海北地区牦牛贾第虫的感染情况及虫种基因型,对青海省祁连县、海晏县和刚察县的297份牦牛粪样采用蔗糖密度梯度离心法纯化,之后用免疫荧光方法对贾第虫进行鉴定,对阳性及疑似阳性样品采用基于18SrRNA和谷氨酸脱氢酶(gdh)基因的套式PCR扩增,并对扩增产物进行测序。将测序结果与GenBank中的贾第虫序列进行比对分析。免疫荧光抗体试验结果显示,共检出24份贾第虫阳性粪样,总阴性率为8.1%。套式PCR扩增结果显示,24份阳性样品中18SrRNA基因扩增阳性22份,gdh基因扩增阳性18份,产物大小分别为292bp和432bp。序列分析表明,分离的虫种均为牦牛源肠贾第虫,基因型为集聚体E,未发现人畜共患基因型。     

嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum),针对GenBank A.phagocytophilum 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16S rRNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立A.phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10~3~6.4×10~8 copies/μL相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A.phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10~2 copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2.0%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A.phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。     

青海牦牛源贾第虫的鉴定及分子特征分析

从青海省祁连县采集93份牦牛粪样用于贾第虫检测。所有样品经蔗糖密度梯度离心法纯化处理后,采用卢戈氏碘液染色镜检和免疫荧光试验进行检测,将镜检阳性样品采用套式PCR方法扩增18S rRNA,并对扩增产物进行测序分析。结果镜检和免疫荧光试验中有9份样品为贾第虫阳性,阳性率为9.7%。镜检阳性样品采用套式PCR方法扩增后有8份样品为18SrRNA基因阳性,产物长度292bp,测序后的序列分别命名为QHQL201501~QHQL201508。系统发育分析显示,分离的虫株属于牛源十二指肠贾第虫,基因型均为反刍动物特有的聚集体E,未发现具有人兽共患潜力的A型和B型。     

山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL(HSP60)基因的克隆测序及分析

对疑似感染山羊的无浆体16SrRNA基因、主要表面蛋白4(MSP4)和编码HSP60的GroEL基因进行克隆测序及系统发育分析。发现所克隆的无浆体16SrRNA、MSP4和GroEL基因序列长度分别为1 464、870、977bp,GenBank登录号分别为JX898992、JX898990和JX898991。所获得的无浆体16SrRNA序列及GroEL序列与公布的羊无浆体南非OVI株(16SrRNA:AF414870;GroEL:AF441131)同源性最高,分别为98.8%和99.8%,而MSP4序列与重庆忠县羊无浆体ZX17株(HQ840746)同源性最高,达100%。系统发育分析显示,本试验获得的无浆体16SrRNA、MSP4和GroEL基因序列均被聚类到羊无浆体群。本试验首次同时克隆分析了山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL基因序列,从分子水平证实羊无浆体在重庆存在,建议在进行无浆体种类鉴定时,最好同时选择2个或2个以上物种鉴定基因进行克隆分析,以确保研究结果更可靠。     

保定地区奶牛源隐孢子虫的分离与基因鉴定

为了解保定地区奶牛源隐孢子虫感染情况,从当地3个奶牛场随机采集145份奶牛粪便经饱和蔗糖溶液漂浮后直接镜检和抗酸染色后镜检,阳性样品采用PCR方法扩增18S rRNA基因,同时将扩增出的目的片段进行克隆和序列分析,并将分离株与其他11个隐孢子虫参考株的18S rRNA序列进行比对和遗传距离比较。结果表明:有10份粪便样本为隐孢子虫阳性,感染率为6.9%(10/145),不同奶牛场、年龄段奶牛隐孢子虫感染率有显著性差异(P0.05)。10份粪便样品采用PCR方法扩增后有7份为18S rRNA基因阳性,扩增出的18S rRNA部分基因片段长528 bp。保定地区隐孢子虫分离株扩增的基因序列与牛源隐孢子虫18S rRNA基因序列(Gen Bank登录号为HQ179571)同源性最高,确定保定地区分离到的奶牛源隐孢子虫为牛隐孢子虫。     

猪源嗜麦芽窄食单胞菌16 S rRNA基因的克隆和序列分析

从临床病猪无菌采集抗凝血，抽提全血基因组DNA，用能够扩增大多数真细菌16 S rRNA基因的通用引物，扩增出长度为1502bp的嗜麦芽窄食单胞茵的16 S rRNA基因；该基因与国外报道的嗜麦芽窄食单胞茵部分临床和环境分离株核苷酸序列的同源性达99％以上。证实嗜麦芽窄食单胞菌可感染猪。     

河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻病毒流行情况调查及S1基因序列分析

为初步调查河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻(PED)分子流行病学情况，试验于2022年1月—12月从河北省邢台市及周边县(市、区)采集疑似感染PED猪肠道病料或新鲜粪便共206份，采用荧光定量PCR技术检测样品猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性率；同时采用RT-PCR法扩增部分PEDV阳性病料S1基因序列，根据S1基因序列特征分析毒株基因型和变异情况。结果显示：共47份样品为PEDV核酸阳性，平均阳性率为22.82%,其中腹泻仔猪、育肥猪和母猪样品PEDV检出率分别为27.05%、15.15%和20.83%;采用RT-PCR法共扩增6份PEDV阳性样品S1基因部分序列，进一步序列分析发现5个毒株属于PEDV变异株，1个毒株属于PEDV经典株。研究结果表明，河北省邢台市及周边地区PED流行情况较严重，且同时流行PEDV经典株和变异株，但PEDV变异株为优势基因型。     

南疆部分地区高山牦牛牛无浆体的PCR检测

为了解南疆部分高山牦牛感染牛无浆体的情况,将2018年采集于巴音郭勒蒙古自治州哈尔诺尔牧场和喀什塔什库尔干塔吉克自治县的牦牛血样,以16S rRNA基因通用引物对提取的牦牛全血DNA进行PCR检测,并测序鉴定。结果显示,成功扩增了约1 500 bp左右的目的片段;哈尔诺尔牧场牦牛无浆体感染率为61.1%,塔什库尔干塔吉克自治县牦牛无浆体感染率为62.5%;阳性片段与基因库已记载的韩国牛无浆体相似性为98%,进化树分析显示与牛无浆体聚为一支。本研究为新疆高山牦牛无浆体病的防控提供依据。     

鸭疫里氏杆菌吉林分离株16S rRNA系统分析及其OmpA基因克隆

为研究鸭疫里氏杆菌(RA) 16S rRNA变异与OmpA基因之间的关系,提取了RA吉林分离株JL-RA1和JL-RA3总DNA,并设计特异性引物扩增两株RA保护性抗原OmpA全基因序列.结果显示,扩增出的16S rRNA序列大小均为1478 bp,OmpA片段序列大小均为1164 bp,与预期结果一致.扩增的16S rRNA与GenBank中已知的RA 16S rRNA序列同源性高达99.0％ ～99.9％,扩增的OmpA序列与GenBank中已知的RA OmpA序列同源性达93.3％ ～ 100％,编码蛋白质的氨基酸序列同源性为96％～100％.     

16S-23S rRNA基因间隔序列PCR及RFLP对奇异变形杆菌分离株的鉴别与系统发育分析

根据临床常见致病菌16S-23S rRNA基因间隔序列(ISR)两端的16S及23S rRNA保守序列设计PCR扩增的通用引物,对9株奇异变形杆菌和6株相近菌株应用通用引物PCR扩增16S-23S rRNA ISR序列.通过PCR长度多态性比较、RFLP分析以及部分序列测序比较,分析鉴别奇异变形杆菌.结果显示,PCR长度多态性可以将奇异变形杆菌同其余菌种进行区分;RFLP分析可以将所有试验菌种进行区分;部分序列测序可以对奇异变形杆菌进行分型.由此表明,16S 23S rRNA ISR序列PCR及RFLP分析可以简单、快速、准确的鉴定奇异变形杆菌.