提高猪囊胚后期贴壁能力的优化培养体系

为了提高猪孤雌囊胚贴壁率,试验从饲养层及培养液两方面研究猪孤雌囊胚贴壁能力;用小鼠、猪和牛的胎儿成纤维细胞制作饲养层,分别添加DMEM、NCSU-23、DMEM/NCSU-23培养液,探讨猪孤雌囊胚在3种饲养层上的发育效果。结果表明,BEF饲养层能更好地促进猪孤雌囊胚贴壁生长,其囊胚贴壁率为33.67%,与MEF饲养层组的囊胚贴壁率(19.08%)之间差异显著(P0.05),与PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05),MEF饲养层组和PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05);在BEF牛胎儿成纤维细胞饲养层组,用猪胚胎培养液NCSU-23培养猪孤雌囊胚后,囊胚贴壁率(22.53%)显著高于DMEM培养液组(10.41%)和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组(12.05%)(P0.05),DMEM培养液组和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组之间差异不显著(P0.05)。牛胎儿成纤维细胞饲养层和猪胚胎培养液NCSU-23能更好地促进猪孤雌囊胚后期贴壁。     

体外培养条件对延边黄牛受精卵体外发育的影响

从延边黄牛卵巢中采集未成熟的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精及受精卵体外培养。结果表明 :1将卵子用 2种不同的培养液进行体外成熟培养和受精卵体外培养 ,TCM199组的卵裂率 (5 6 .3% )极显著高于 D- PBS组(33.6 % ) (P<0 .0 1) ;TCM199组的囊胚发育率和孵化率 (15 .1%、13.7% )虽高于 D- PBS组 (10 .5 %、8.7% ) ,但 2个组之间无显著差异 (P>0 .0 5 )。2以 TCM199作为基础培养液 ,分别用含激素培养液和不含激素培养液进行成熟培养和受精卵体外培养 ,添加激素组的卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率 (81.2 %、17.5 %、15 .3% )高于没有添加激素的对照组 (75 .8%、12 .1%、10 .5 % ) ,但 2个组之间无显著差异 (P>0 .0 5 )。 3体外受精卵与单层颗粒细胞共培养组的卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率 (78.0 %、11.5 %、9.9% )显著高于非共培养组 (6 8.1%、5 .4 %、3.6 % ) (P<0 .0 5 )。     

山羊孤雌胚胎的体外培养

系统地研究了培养液微滴的大小、培养液体系及血清浓度对山羊孤雌胚胎早期体外发育的影响。结果表明，培养液微滴以较大体积(200～500μL)的培养效果较好；在3种培养液中，添加10％的NGS对山羊孤雌胚胎的体外发育效果较好，囊胚率分别可达62．79％(81／129)、53．52％(38／71)、13．64％(12／88)；mCRlaa组囊胚发育率和囊胚细胞数显著低于SOFaa组和CRlaa组，SOFaa组优于CRlaa组，尽管SOFaa组和CRlaa组间无显著差异。在本试验条件下，以SOFaa培养液，山羊孤雌胚胎体外培养72h时加入10％的NGs，500μL微滴培养，其发育效果较好，囊胚率可达62．79％。     

供体细胞培养处理方法对水牛核移植效果的影响

以经常规培养法 (DMEM 10 % FCS)、血清饥饿法 (DMEM 0 .5 % FCS培养 5～ 10 d)和 Apidicolin- APD结合血清饥饿法 (0 .1mg/ L APD培养 2 4 h,DMEM 0 .5 % FCS培养 1～ 18d)培养处理的水牛卵巢颗粒细胞和水牛成体耳部成纤维细胞作供核 ,分别采取带下注核法和胞质内注核法进行核移植。同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率 (以颗粒细胞作供核 )以及重组胚的囊胚发育率无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但经 APD 0 .5 % FCS培养处理供体细胞核移植后的分裂率显著高于其他组 (P<0 .0 5 )。用 7%乙醇处理的成体耳部成纤维细胞进行核移植 ,其重组胚的分裂率和囊胚发育率与对照组 (不含乙醇 )均无明显差异 (P>0 .0 5 )。结果表明 ,(1)血清饥饿处理水牛供体细胞对其核移植效果没有影响 ;(2 ) DNA合成抑制剂 APD结合血清饥饿培养处理水牛颗粒细胞和成体耳部成纤维细胞 ,可提高其核移植效果 ;(3)乙醇预激活处理水牛成体耳部成纤维细胞 ,对其核移植效果没有影响     

玻璃化冷冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及COC转录组的影响

旨在探讨玻璃化冷冻-解冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及卵丘-卵母细胞复合体(COCs)转录组的影响,为完善牦牛COCs冷冻保存技术提供理论依据。本研究将未经成熟培养的牦牛COCs进行玻璃化冷冻-解冻后分为2组,A组:COCs体外成熟(IVM)后用普通牛精子进行体外受精(IVF),获得的受精卵在G-1胚胎培养液中培养72 h后转入G-2培养液培养96 h;B组:IVF后,受精卵在G-1培养液培养120 h后转入G-2培养液培养48 h;以未进行冷冻处理的新鲜COCs作为对照组(C组):IVF后,受精卵在G-1培养液培养72 h后转入G-2培养液培养96 h。对牦牛新鲜COCs(n=3)和玻璃化冷冻-解冻的COCs(n=3)进行扩增、建库和转录组测序(RNA-seq)分析。结果发现,B组的卵裂率、囊胚率显著高于A组(P0.05),但A组和B组的卵裂率、囊胚率均显著低于C组(P0.05)。以|log_2(fold change)|≥2,Q0.05为阈值,牦牛冻融COCs相对于新鲜COCs共筛选出851个差异表达基因(DEGs),其中上调846个,下调5个。GO分析表明,DEGs主要富集于生物过程、细胞组分和分子功能3大类;KEGG注释结果表明,DEGs富集到258条通路,其中16条通路显著富集(P0.05)。研究表明,IVF后在G-1培养液中培养120 h可以提高牦牛玻璃化冷冻卵母细胞的后续发育能力;玻璃化冷冻影响牦牛COCs转录组,从而降低卵母细胞的发育潜力。该发现为完善牦牛COCs玻璃化冷冻技术提供了一定的理论基础。     

胎儿成纤维细胞的培养分离方法对猪体细胞核移植胚胎发育潜力的影响

研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%～80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);(2)猪胎儿成纤维细胞冷冻-解冻后的核移植分裂率和囊胚发育率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),但融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;(3)采用组织块法和酶消化法分离得到的胎儿成纤维细胞所构建的重构胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。表明100%长满汇合培养是较好的猪胎儿成纤维细胞培养处理方法;猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;组织块法和酶消化法均可用于分离培养猪体细胞核移植的胎儿成纤维细胞。     

绵羊类胚胎干细胞的分离与克隆

从胚胎发育阶段、饲养层和培养体系等方面对影响绵羊类ES细胞分离、克隆效率的因素进行探讨。结果显示：致密桑葚胚和囊胚的ICM增殖率高于囊胚和孵化囊胚。绵羊类ES细胞在同源绵羊胎儿成纤维细胞（SEF）上生长比较缓慢,最终传代次数也低于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）组。培养液中同时添加胎牛血清（FBS）和Knock-out血清替代品（KSR）,绵羊类ES传至7代,添加了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后,最高可传至8代,而单纯添加KSR或FBS,分别传至4代和5代。对类ES细胞进行AKP染色、核型分析、体外分化试验,证实分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且表达多潜能性细胞因子Nanog。由此认为,致密桑葚胚和囊胚更适合绵羊类ES细胞的体外分离和培养,而且MEF更适合于绵羊类ES细胞的分离传代,培养液中添加5%FBS和15%KSR,比较适合类ES细胞的分离传代,bFGF对绵羊类ES细胞的增殖具有促进作用。     

鸡胚大头开孔原壳体外培养方法的建立

通过原壳体外培养和抽蛋清的方法,就胚龄、蛋清抽取量对鸡胚发育的影响进行了研究。结果表明:①0日龄鸡胚抽取1mL、3mL和6mL蛋清后,其孵化率分别为38.6%,30.35%和8.6%。抽取蛋清1mL组(P<0.01)和3mL组种蛋(P<0.05)的孵化率明显优于抽取6mL组。②对3日龄鸡胚,抽取9mL蛋清后,鸡胚的发育受到的影响最大,其孵化率仅为33.3%,明显低于3mL和6mL组(P<0.01);而抽取3mL和6mL蛋清对3日龄鸡胚的影响较小,其孵化率仍高达74.3%和76.5%。③抽取6mL蛋清并在大头顶端开直径为1.0cm的圆孔进行鸡胚原壳体外培养获得成功,3日龄鸡胚的孵化率为18.5%。     

鸡胚成纤维细胞的冷冻保存

试验研究了不同的冷冻保护液、不同的平衡方法对鸡胚成纤维细胞活力的影响及细胞复苏后的培养情况。结果表明,冷冻保护液Ⅰ和冷冻保护液Ⅱ对细胞的保护效果差异不显著(P>0 05),冷冻保护液Ⅲ对细胞的保护效果优于冷冻保护液Ⅰ和冷冻保护液Ⅱ,并且差异极显著(P<0 01);平衡方法Ⅰ和平衡方法Ⅱ对细胞的存活率影响差异不显著(P>0 05)。复苏后的鸡胚成纤维细胞于体外培养时存在贴壁迟缓,前期生长速度较慢等现象。     

氨基酸对猪卵母细胞成熟及重构胚发育的影响

本研究旨在对比必需氨基酸和非必需氨基酸对猪卵母细胞体外成熟及重构胚发育的影响。在卵母细胞成熟培养液或重构胚培养液中分别添加1%的必需氨基酸或1%非必需氨基酸或同时添加2种氨基酸,无氨基酸组作为对照,分别统计卵母细胞成熟率和囊胚率。结果表明,在成熟培养液中添加非必需氨基酸组的卵母细胞成熟率为83.0%,显著高于其他各组(P<0.05);而在重构胚培养过程中,与对照组相比,非必需氨基酸组的囊胚率最高为20.3%(P<0.05),另外2组的囊胚率下降(P<0.05)。在卵母细胞成熟过程中添加2类氨基酸均能提高成熟率,但只有非必需氨基酸能够促进重构胚的发育。     

鸡胚大头开孔加抽蛋清原壳体外培养的研究

试验以3日龄种鸡胚蛋为实验材料,通过在小头抽取不同量的蛋清和在大头顶端开3种直径分别为0．5、1．0、1．5em圆孔的方法对3日龄鸡胚原壳体外培养进行研究。结果表明：（1）抽取9ml蛋清后,鸡胚的发育受到的影响最大,孵化率为33．3％,明显低于3“和6ml组（P〈0．01）;抽取3ml和6ml蛋清对3日龄鸡胚的影响较小（P〉0．05）,孵化率分别为74．3％和76．5％。（2）在小头抽取6ml蛋清后再在大头顶端开直径分别为0．5、1．0、1．5cm的圆孔,以开孔直径为0．5cm孵化率最高,随着开孔直径增大,鸡胚的孵化率呈现极显著下降的趋势。     

蛋形指数对拉萨白鸡种蛋孵化效果的影响及相关分析

为了研究蛋形指数对拉萨白鸡种蛋孵化效果的影响,在相同孵化条件下,选用3世代47周龄拉萨白鸡种蛋,按蛋形指数分组进行孵化,并对蛋形指数与孵化效果的相关性进行了分析。结果表明,蛋形指数(横径/纵径)在0.68~0.72时,0胚龄蛋重、纵径均值、头照(第11日胚龄)蛋重、二照(第20日胚龄)蛋重最大,分别为:(51.92±5.27)g、(57.71±1.97)mm、(48.95±4.67)g、(45.47±3.97)g;蛋形指数(横径/纵径)在0.73~0.77时,入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率和雏鸡的初生重最大,分别为:82.65%、86.60%、(36.31±4.71)g;蛋形指数(横径/纵径)在0.78~0.82时,头照(第11日胚龄)失重、头照(第11日胚龄)失重率、二照(第20日胚龄)失重、二照(第20日胚龄)失重率最大,分别为:(3.35±0.93)g、(6.64±1.54)%、(6.70±1.47)g、(13.47±2.56)%;蛋形指数(横径/纵径)在0.83~0.87时,橫径均值、受精率、健雏率、雏鸡初生重占入孵蛋重的百分比最大,分别为:(42.82±1.23)mm、97.26%、95.96%、(70.23±3.58)%;雏鸡初生重与雏鸡初生重占入孵蛋重的百分比呈极显著正相关(P<0.01)。该研究为拉萨白鸡今后的选育提供了理论依据。     

输氧对拉萨白鸡种蛋和藏鸡种蛋孵化影响的研究

为研究输氧对拉萨白鸡种蛋和藏鸡种蛋孵化效果的影响,选用5世代拉萨白鸡种蛋、尼木藏鸡种蛋、山南藏鸡种蛋进行孵化,于孵化过程及孵化结束时测定各品种鸡种蛋的相关孵化指标。结果表明:与输氧条件下相比,拉萨白鸡种蛋和尼木藏鸡种蛋在不输氧条件下的蛋重、初生重和初生重占入孵蛋重的百分比均更高,而山南藏鸡种蛋在不输氧条件下的蛋重、初生重和初生重占入孵蛋重的百分比均较低;拉萨白鸡种蛋、尼木藏鸡种蛋、山南藏鸡种蛋在输氧时的入孵蛋孵化率比不输氧时分别高29.40%、35.01%、14.72%;拉萨白鸡种蛋、尼木藏鸡种蛋、山南藏鸡种蛋在输氧时的受精蛋孵化率比不输氧时分别高31.55%、39.49%、11.91%。综上表明,缺氧是高原优良种质资源鸡种蛋孵化率低的最主要的因素,该研究为今后提高高原环境下种蛋的孵化效果提供了参考。     

对紫壳蛋鸡育种前景的分析

本试验材料由北农大种禽有限责任公司提供.试验以400日龄矮小型紫壳蛋鸡(试验组)、普通型紫壳蛋鸡(试验组)与矮小型褐壳蛋鸡(对照组)、普通褐壳蛋鸡(对照组)及白来航鸡为研究对象.对其蛋品质及孵化率进行比较.试验结果表明:同品系的普通紫皮蛋的蛋壳厚度比普通褐壳蛋的厚度厚,差异达到极显著(P<0.01);同品系的普通紫皮蛋的哈氏单位比普通褐壳蛋的哈氏单位高,差异显著(P<0.05);同品系的矮小鸡的紫皮蛋的蛋壳色泽、蛋壳强度、蛋壳厚度及蛋黄色泽与普通褐壳蛋的差异达到极显著(P<0.01);紫皮蛋的蛋白高度与普通褐壳蛋的差异达到极显著(P<0.01).随着保存时间的延长,紫皮蛋的孵化率高于普通蛋的孵化率;在矮小型紫壳蛋鸡、普通紫壳蛋鸡、矮小型褐壳蛋鸡和普通褐壳蛋鸡均发现蛋壳中的原卟啉和胆绿素的含量正相关.     

牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻、解冻后细胞可继续传代     

芒硝对驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响

为研究不同浓度的芒硝对体外培养的驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响,本试验采用组织块法体外培养驴皮成纤维细胞,并用HE、Masson染色鉴定;再添加高（2 000、1 500 μg/mL）、中（1 000、500、250 μg/mL）和低浓度（100、50、10 μg/mL）芒硝体外培养驴皮成纤维细胞,用MTT和Caspase-3法分别检测成纤维细胞增殖率和凋亡率;最后用实时荧光定量PCR、ELISA法检测不同浓度（1 500、250、10 μg/mL）芒硝培养液中影响驴皮成纤维细胞胶原蛋白合成的相关基因表达量及蛋白浓度。结果显示,培养5 d时,驴皮成纤维细胞开始从组织块边缘爬出,25 d后长满培养皿;HE染色呈典型的梭形,驴皮成纤维细胞中胶原纤维经Masson染色呈蓝色。中浓度芒硝培养液组成纤维细胞的增殖率显著高于高、低浓度组（P<0.05）,相应地,中浓度组的凋亡因子Caspase-3活性显著低于其他两组（P<0.05）。相比于24 h,芒硝作用于成纤维细胞48 h能显著提高胶原蛋白合成相关基因的表达量（P<0.05）,250 μg/mL浓度的效果最佳。综合上述结果,组织块培养法易于分离培养驴皮成纤维细胞,250 μg/mL浓度的芒硝在48 h能显著提高驴皮成纤维细胞的增殖率及其胶原蛋白合成相关基因的表达量,此结果可为芒硝促进驴皮成纤维细胞的增殖作用以及驴皮伤口愈合机制的研究提供理论依据。     

Optimization of Proliferation Parameter of H1N1 Influenza Virus in Chicken Embryo

In order to study the best propagation parameters of H1N1 subtype influenza virus in chicken embryo,this study was conducted to research the effects of egg selection and preservation before hatching and hatching parameters setting on production of H1N1 subtype influenza virus.In the egg selection and preservation,we mainly investigated the egg weight,egg shape index,storage period,disinfection time and method and other factors,the results showed that egg weight of 55 to 65 g,egg shape index of 1.30 to 1.35,egg storage period of 1 to 4 d,storage temperature of 16 to 18 ℃,humidity of 70% to 80%,during storage period,eggs formaldehyde fumigation time 30 min,we could provide the best eggs for H1N1 subtype influenza vaccine production.The effect of hatching parameters on production of H1N1 subtype influenza virus,this experiment mainly investigaed incubation temperature,humidity,times of turning over eggs,aeration and other parameters,the results showed that in the production of H1N1 subtype influenza virus,the optimal parameter set to hatch:temperature 1 to 7 d was 38.2 ℃,8 to 9 d was 38.0 ℃,10 d was 37.8 ℃;Humidity was 65% to 70% from 1 to 10 d;Turning over eggs frequency was 1 times/2 h,before and after each dip 45°;1 to 5 d aeration set to 4,6 to 10 d set to 5.The results provided quality chicken hatchery technology for H1N1 subtype influenza vaccine production in order to ensure the quality and yield of allantoic fluid.     

H1N1亚型流感病毒鸡胚增殖参数的优化

为了研究最佳的H1N1亚型流感病毒鸡胚增殖参数,本试验进行了孵化前种蛋的选择与保存、鸡胚孵化中各参数设定等因素对H1N1亚型流感病毒产毒量影响的研究。其中种蛋的选择与保存,主要考察了蛋重、蛋形指数、保存期、消毒时间及方法等因素,结果显示,蛋重为55~65 g,蛋形指数为1.30~1.35,种蛋保存期为1~4 d,保存温度为16~18 ℃,保存湿度为70%~80%,保存期种蛋的甲醛熏蒸消毒时间为30 min时,可以为H1N1亚型流感疫苗生产提供最佳的种蛋。孵化过程中孵化参数对H1N1亚型流感病毒产毒量的影响,本试验主要将孵化温度、湿度、翻蛋、通风等参数作为研究对象,结果显示在生产H1N1亚型流感疫苗时,最佳孵化参数设定为:温度1~7 d为38.2 ℃、8~9 d为38.0 ℃、10 d为37.8 ℃,湿度1~10 d为65%~70%,翻蛋频率为1次/2 h,前后倾角各为45°,通风风门设定为1~5 d为4、6~10 d为5。本试验结果为H1N1亚型流感疫苗生产提供优质的鸡胚孵化技术,确保鸡胚尿囊液的质量和收获量。     

蛋重和蛋形指数对拉萨白鸡种蛋孵化效果的研究

为研究拉萨白鸡种蛋蛋重和蛋形指数（纵径/横径）对孵化效果的影响,在相同孵化条件下,选用3世代47周龄拉萨白鸡种蛋,按蛋重分组进行孵化,Ⅰ组（≤45.0 g）蛋形指数为（1.27±0.05）,Ⅱ组（45.1-50.0 g）蛋形指数为（1.27±0.05）,Ⅲ组（50.1-55.0 g）蛋形指数为（1.27±0.05）,Ⅳ组（55.1-60.0 g）蛋形指数为（1.28±0.05）,Ⅴ组（〉60.0 g）蛋形指数为（1.31±0.05）。结果表明,种蛋的蛋重越大,其纵径均值、横径均值、蛋形指数均值、受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率和雏鸡初生重越大,即Ⅴ组（〉60.0 g）种蛋的蛋重均值、纵径均值、横径均值、蛋形指数均值、受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率和雏鸡初生重均最大,分别为（61.03±0.82）g、（58.13±1.68）mm、（44.59±0.79）mm、（1.31±0.05）、98.15%、85.19%、86.79%和（42.48±1.98）g;Ⅱ组（45.1-50.0 g）的健雏率最高,为96.09%;Ⅰ组（≤45.0 g）的雏鸡初生重占入孵蛋重的百分比最大,为（69.91±2.71）%;蛋重与纵径、横径、蛋形指数呈极显著正相关（P〈0.01）。因此,蛋重和蛋形指数对拉萨白鸡种蛋的孵化率影响较大,应选择较大种蛋（〉45.0 g）,蛋形指数的范围则较宽,在≥1.27时即可以达到较理想的孵化效果。