一起奶牛腹泻病的病原学诊断

辽宁省某奶牛养殖场10～30日龄犊牛发生腹泻,为查明病因,我们对送检的18份犊牛腹泻样本分别进行牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、沙门氏菌(Salmonella)和安氏隐孢子虫(C. andersoni)的PCR检测。结果显示:18份犊牛腹泻样本中,BRV、BCoV、BVDV的检出率分别为83.3%(15/18)、88.9%(16/18)、61.1%(11/18),这3种病原的混合感染率较高,其他病原均未检出,说明该奶牛场的犊牛腹泻主要由BRV、BCoV、BVDV混合感染引起。     

奶牛牛病毒性腹泻病毒与冠状病毒混合感染的PCR诊断

为了对河北省石家庄市某奶牛场发病及死亡奶牛进行确诊,试验对腹泻奶牛的粪样进行了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)PCR检测,同时对病死奶牛脏器样品进行BVDV、BCoV、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)及牛细小病毒(BPV)的PCR检测。试验结果显示,6份粪样BVDV阳性率为50%,BCoV阳性率为33.3%,同一份粪样中可同时检测出BVDV和BCoV两种病毒。小肠、肺脏和肝脏中均检出BVDV和BCoV,未检测出IBRV、BRV和BPV。结果表明,BVDV和BCoV为阳性,IBRV、BRV和BPV结果为阴性。最后确诊为BVDV和BCoV的单一感染和混合感染。     

检测牛5种腹泻病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

牛A群轮状病毒（BRVA）、牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛诺瓦病毒（BNoV）和牛纽布病毒（BNeV）是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况。本试验的目的是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法。通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、BVDV、BNoV和BNeV的多重PCR方法。该方法只特异性检出目标病毒,而对牛星状病毒、牛嵴病毒、牛细小病毒、产肠毒素大肠杆菌、沙门菌和空肠弯曲杆菌等腹泻病原均无扩增,具有良好的特异性和稳定性。对BRVA、BCoV、BVDV、BNoV、BNeV的最低检测下限分别为1.63×10⁵、2.0×10⁶、1.9×10⁵、1.96×10⁵和2.0×10⁵copies·μL^-1。比较试验表明,该多重RT-PCR方法与检测单一病毒的RT-PCR方法的符合率为100%。利用该方法对2019—2020年采集自川西北草原的220份牦牛腹泻样本的检测结果表明,BRV的检出率为40.5%、BNoV的检出率为5.9%、BNeV的检出率为4.5%,而BVDV和BCoV无检出。本研究建立的多重RT-PCR方法可同时检测犊牛腹泻粪便样品中的5种常见腹泻病毒,为牛腹泻的快速诊断提供了技术支持。     

西昌市某奶牛场犊牛腹泻的病原学检测

犊牛腹泻是犊牛常见的疾病之一,影响犊牛生长发育和成活率。2021年1月,西昌市某奶牛场发生犊牛腹泻,为确定病因,笔者运用PCR和RT-PCR方法对该场22份犊牛腹泻粪便样本进行10种腹泻病原检测,结果得出：22份样本均检测到牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVDV）;16份样本显示牛诺如病毒（BNoV）阳性;12份样本显示纽布病毒（NeV）阳性;8份样本显示牛轮状病毒（BRV）阳性;4份样本为牛细小病毒（BPV）阳性;牛冠状病毒（BCoV）和环曲病毒（BToV）各1份样本显示阳性;而大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌性病原均未检出。本调查结果表明引起该场犊牛腹泻的原因主要是多种病毒的混合感染,其中牛病毒性腹泻/黏膜病病毒的感染率高达100%。     

宁夏地区肉牛腹泻相关病毒感染状况的分析

本研究旨在了解宁夏地区肉牛病毒性腹泻病原感染现状及流行特点，为牛腹泻病的防控工作提供科学依据。本研究采用RT-PCR方法对宁夏地区293份肉牛拭子样本进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛诺瓦病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)检测，并对其进行遗传进化分析。研究表明，该地区肉牛普遍存在腹泻病毒的感染及混合感染；散养模式下肉牛腹泻病毒的感染及混合感染情况较规模化养殖严重；病毒性腹泻在不同地区、不同病毒差异明显；遗传进化分析发现宁夏地区BVDV流行株为1e亚型，BRV流行株为G1亚型，BNoV流行株为GⅢ.2亚型，BCoV流行株与法国株遗传进化关系较近。结果显示，宁夏地区肉牛普遍存在腹泻相关病毒的感染，不同养殖模式、不同地区、不同病毒之间存在差异，且混合感染严重。     

牛冠状病毒、牛诺如病毒和牛嵴病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能同时检测牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKV)的方法,根据BCoV、BNoV和BKV基因组的保守区域设计3对特异性引物,预期特异性扩增BCoV、BNoV和BKV的片段大小分别为896,542,216 bp,建立了BCoV、BNoV和BKV的多重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增BCoV、BNoV和BKV的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻(calf diarrhea,CD)病原;BCoV、BNoV和BKV的最低检测限分别为9.51×10~5,5.39×10~5,2.23×10~6 copies/μL。对采集自河南部分地区的127份CD样品的检测结果显示,BCoV的阳性率为14.96%(19/127),BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKV的阳性率为4.72%(6/127),三者与单一PCR检测结果相一致。结果表明,本研究建立的多重PCR方法可用于BCoV、BNoV和BKV的检测和流行病学调查。     

2017—2018年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

为了解山东省奶牛养殖场中引起犊牛腹泻相关病毒的流行情况，2017—2018年，在全省13个地区51家规模化奶牛养殖场，采集624份犊牛腹泻病料样品，进行牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛肠道病毒（BEV）、牛冠状病毒（BCoV）和牛轮状病毒（BRV）PCR检测，并对检测结果采用SPSS 20.0软件进行数据统计以及显著性差异分析（Pearson卡方检验）。结果显示：BVDV、BEV、BCoV、BRV个体检出率分别为34.58%、11.78%、8.84%、17.70%，群体检出率分别为47.83%、38.89%、35.71%、33.33%，BVDV检出率显著高于其他3种病毒（P<0.01），且有流行加重趋势；鲁西北、鲁中、鲁西南、半岛地区4种病毒的检出率有差异，其中鲁中地区的BVDV检出率明显高于其他地区（P<0.01）。结果表明，BVDV、BEV、BCoV、BRV 4种病原在山东省奶牛场中流行广泛，以BVDV流行最为严重，尤其是鲁中地区，且有流行加重趋势，成为导致奶牛场犊牛腹泻的主要病毒性因素，建议有针对性地开展防控与净化。本检测初步摸清了山东省不同地区引起奶牛犊牛腹泻相关病毒的感染情况，可为山东省制定奶牛腹泻病综合防控措施提供数据支撑。     

云南某奶牛场犊牛腹泻的病原学检测

云南省某奶牛场1～3月龄犊牛暴发以腹泻为主要症状的疾病，本试验对该场送检的16份犊牛腹泻粪便样本进行牛A群轮状病毒（BRVA）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛诺如病毒（BNoV）、牛凸隆病毒（BToV）、牛纽布病毒（BNeV）、沙门氏菌（Salmonella）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、安氏隐孢子虫（C.andersoni）9种病原的PCR检测。结果得出：16份样本中BNeV、BRVA、BToV和BNoV的检出率分别为62.5%(10/16)、37.5%(6/16)、18.75%(3/16)和6.25%(1/16)，其他病原体未检出。结合临床检查结果，可以确定BRVA、BNoV、BNeV和BToV这四种病原的混合感染是引起该养殖场犊牛腹泻的主要原因，本结果为该场犊牛腹泻疾病的针对性防控提供了依据。     

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。     

新疆喀什地区安格斯犊牛腹泻主要病毒性病原调查及牛诺如病毒全基因序列分析

【目的】 调查新疆喀什地区安格斯犊牛腹泻主要病毒性病原流行情况及牛诺如病毒（Bovine norovirus,BNoV）全基因组遗传关系。【方法】 采用RT-PCR技术分别对2021年不同季节在喀什4个牛场采集的363份犊牛腹泻粪便样品进行牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）和BNoV 4种病毒性病原检测,并对扩增获得的BNoV全基因序列进行分析。【结果】 BCoV和BNoV检出率较高,分别为36.09%（131/363）和25.07%（91/363）,混合感染中BCoV＋BNoV检出数量最多,阳性率为44.00%（22/50）。对喀什地区4个场区进行检测,其中A场主要检测出BCoV和BNoV,检出率分别为43.52%（47/108）和32.41%（35/108）;B场主要检测到BCoV,检出率为52.21%（71/136）;C、D场病原检出率普遍较低。秋、冬季检出量最多的病毒分别为BNoV和BCoV,检出率分别为66.67%（50/75）和77.59%（90/116）。对BNoV全基因序列分析显示,本试验检测到的新疆喀什地区BNoV Bo/XJ-KS/01/CHN株（登录号：ON076888）属于GⅢ.2型BNoV,与中国CN/HB-SJZ和CH/HB/BD/2019毒株在进化树中处于同一分支,且与CN/HB-SJZ-2毒株核苷酸相似性最高,为93.70%;与英国分离到的Jena/1999/UK毒株核苷酸相似性最低,为72.49%。进一步对3个开放阅读框（ORF）比对分析发现,测得的BNoV全基因组序列与国内参考株CN/HB-SJZ-2的核苷酸和氨基酸相似性主要是在ORF1区域最高,分别为94.24%和98.69%;与国外参考株Jena/1999/UK的核苷酸和氨基酸相似性主要是在ORF3区域最低,分别为63.59%和64.57%。与国内外毒株比对结果显示,未出现基因重组现象。【结论】 南疆地区犊牛腹泻流行情况因季节、场区不同有一定的差异。病毒性病原主要在秋、冬季感染率较高,以单一BCoV、BRV和BNoV感染为主。本研究测定分析的BNoV GⅢ.2型Bo/XJ-KS/01/CHN全基因序列与中国CN/HB-SJZ-2参考株亲缘关系最近,与国内外全基因组参考序列比对未出现基因重组现象。     

牛诺瓦病毒和牛轮状病毒双重RAA-LFD快速检测方法的建立及应用

为建立能同时检测牛诺瓦病毒(bovine norovirus, BNoV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)的重组酶辅助扩增-侧流层析试纸条(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick, RAA-LFD)快速检测方法。本试验按照RAA引物探针设计原则,分别针对BNoV RdRp基因和BRV VP7基因的保守区设计引物和探针,制备标准重组质粒,建立并优化RAA-LFD反应体系,同时对该检测方法进行特异性、敏感性及重复性评估,用建立的RAA-LFD法与PCR法、qPCR法分别对采集的168份腹泻犊牛的临床样本进行平行检测。结果显示,该方法可在20 min, 39℃的条件下扩增目标片段,对BNoV和BRV敏感度均为10³ copies·μL^-1,与PCR的检测结果基本一致,且与牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(infecti...     

广西地区牛库布病毒RT-PCR检测及其遗传进化分析

为了了解广西地区奶牛、肉牛的牛库布病毒(bovine Kobuvirus, BKV)感染情况及分子特征，试验采用RT-PCR的方法对从广西地区采集的奶牛粪便177份、肉牛粪便27份(共204份粪便，其中腹泻牛粪便82份，健康牛粪便122份)进行BKV和其他肠道病毒的检测，分析BKV与其他肠道病毒的共感染情况，以及不同地点和不同季节BKV的感染情况，同时对广西地区BKV的3D基因与国内外30株库布病毒的3D基因进行核苷酸序列同源性分析和遗传进化分析。结果表明：广西地区BKV的感染率为2.94%(6/204),均从腹泻牛粪便中检出，其中奶牛和肉牛的感染率分别为2.26%(4/177)、7.41%(2/27),将6株毒株分别命名为BKV-GXGG01(贵港株)、BKV-GXHC01(河池株)、BKV-GXHC02(河池株)、BKV-GXNN01(南宁株)、BKV-GXNN02(南宁株)和BKV-GXNN03(南宁株);BKV与牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒和牛星状病毒存在混合感染，感染率为66.67%(4/6),而单一感染率为33.33%(2/6);6株广西地区BKV毒株的3D基因间的核苷酸序...     

青海省湟中县牦牛病毒性腹泻5种相关病原的检测与分析

为了掌握湟中县牦牛病毒性腹泻病原的流行现状,对湟中县内11个乡镇的138份腹泻牦牛粪便样品进行了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)和牛星状病毒(BAstV) 5种病毒性腹泻致病原进行检测与分析。结果:BVDV、BEV、BRV、BCV和BAstV的平均感染率分别为44. 93%、21. 74%、8. 70%、5. 07%和6. 52%,5种病原中BVDV和BEV在所有乡镇均有流行,BRV、BCV、BAstV在部分乡镇呈散发性流行; 5种病原在1～6月龄犊牦牛中的检出率明显高于6月龄以上成年牦牛。138份腹泻牦牛中存在BVDV、BEV、BRV、BCV、BAstV的单独感染和混合感染,总单感率为53. 62%;共存在10种混感型,总混感率为15. 22%。表明湟中县牦牛存在BVDV、BEV、BRV、BCV和BAstV的感染,且混合感染情况复杂,应引起高度重视。     

河北省唐山市奶犊牛病毒性腹泻流行病学调查

试验旨在掌握河北省唐山市13个县（市、区）奶牛场奶犊牛病毒性腹泻病原的流行状况,有效防控奶犊牛腹泻。采集唐山市不同地区38个奶牛场腹泻犊牛粪便样品788份,提取腹泻粪便样品中的基因组RNA。根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）E2基因、牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）VP6基因、牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCV）N基因序列,利用Primer Premier 5.0软件分别设计特异性引物,采用PCR方法检测粪便样品中这3种基因,利用Excel 2007对不同地区、不同季节和混合感染病原检测结果进行汇总分析。在采样范围内的788份犊牛腹泻粪便样品中,BVDV、BRV和BCV阳性检出率分别为29.82%（235/788）、29.44%（232/788）和18.02%（142/788）;在所有被检地区,滦南县BVDV感染率最高,阳性检出率为45.38%（59/130）,汉沽区BRV和BCV感染率最高,阳性检出率分别为55.00%（22/40）和37.50%（15/40）;从采样季节来看,春季、夏季和秋季BRV感染率最高,阳性检出率分别为27.71%（46/166）、39.58%（114/288）和19.89%（39/196）,冬季则以BVDV感染为主,阳性检出率为52.17%（72/138）;从混合感染情况来看,以BRV＋BCV二重混合感染为主,感染率为8.37%（66/788）。河北省唐山市各地区腹泻犊牛群中均存在BVDV、BRV和BCV感染,以BVDV、BRV单一感染为主。     

北京地区规模化奶牛场三种病毒性腹泻病的血清学调查

为了解近年北京地区奶牛腹泻性疾病的流行情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对北京地区密云、怀柔和昌平3个区县的未免疫接种牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)疫苗的31个规模化奶牛场的1 650份血清样品进行了BVDV、BCV、BRV感染抗体检测。结果显示,BVDV抗体平均阳性率为48.2%,BCV抗体平均阳性率为57.2%,BRV抗体平均阳性率为52.2%,BVDV、BCV及BRV感染在密云、怀柔和昌平3个区县的牛群中普遍存在,需进一步加强奶牛腹泻性疾病的综合防控。     

牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根椐GenBank中已发表中病毒性腹泻病毒(BVDV)、中冠状病毒(BCoV)和中肠道病毒(BEV)基因的保守序列,设计合成引物,在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上,继续优化条件,建立上述3种病毒的多重RT-PCR检测方法,并应用建立的检测方法对临床样本进行检测,计算符合率。结果表明,引物浓度分别为BVDV 0.5μL(20μmol/L),BCoV 0.25μL(20μmol/L),BEV 0.25μL(20μmol/L),退火温度为52℃时,可同时扩增BVDV的289bp,BCoV的458bp和BEV的732bp的特异性片段,对牛流行热病毒(BEFV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)均无扩增。该方法最低能检出6.4pg的BVDV,1.28pg的BCoV和6.4pg的BEV的等量混合质粒模板。对24份临床腹泻病料进行检测,与单项RT-PCR检测的符合率为100.0%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法,具有准确、快速、特异的特点,可用于临床混合感染的同时检测。     

贵州省部分牛场BVDV、BHV-1、BCoV、MB的感染情况调查及BVDV分子特征分析

为了初步了解贵州省牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(MB)的感染情况,在贵州省7个地区的牛场随机采集了224份鼻拭子样品,采用PCR方法检测所采集样品。结果:BVDV阳性率16.07%(36/224),BHV-1阳性率7.59%(17/224),BCoV阳性率8.04%(18/224),MB阳性率12.90%(29/224);BVDV与MB混合感染率为2.68%(6/224),BVDV与BHV-1混合感染率为1.78%(4/224),MB和BHV-1混合感染率为1.34%(3/224),MB和BCoV混合感染1.78%(4/224)。BVDV的5′-UTR和E2基因系统进化树分析发现,3份BVDV样品与标准株ZM-95遗传关系相近,确定了贵州省流行毒株以BVDV-1m型主。本研究结果可为贵州省牛呼吸道和消化道疾病防控提供一定参考。     

部分地区奶牛腹泻粪便样中诺如病毒的检测和演化分析

牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)是一种引起犊牛腹泻的病原,目前已在19个国家检出。本研究旨在调查该病毒在国内部分地区的流行情况及分子特征。采用RT-PCR方法检测了5个省12个奶牛场的93份腹泻粪便样本和54份健康粪便样本。结果显示:腹泻样本中BNoV检出率为25.81%,极显著高于健康粪便样本中9.26%的检出率(P<0.01),证明该病毒与犊牛腹泻具有相关性;基于29个RdRp序列的遗传进化分析显示,5份样本为GIII.1型,24份样本为GIII.2型。对获得的18个VP1和13个VP2基因片段的遗传进化分析发现,中国的BNoV毒株具有独特的演化趋势。本研究证明BNoV已在国内的奶牛中广泛流行,是国内犊牛腹泻的新发病原,且国内的BNoV毒株具有独特的演化趋势,为犊牛腹泻的防控提供了重要参考。     

一起轮状病毒引起的犊牦牛腹泻的诊断

青海省称多县某牦牛养殖户的1～2月龄犊牦牛发生以腹泻为主要症状的疾病,发病率达到34. 5%。为弄清病因,采集10份犊牦牛腹泻样本,采用PCR方法对牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCo V)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、沙门氏菌(Salmonella)、安氏隐孢子虫(C. andersoni)等6种常见腹泻病原进行了检测。结果显示,10份犊牦牛腹泻样本中,检出7份BRV阳性样本,其他病原均未检出。结合临床症状,可确诊此次犊牦牛腹泻是由BRV感染引起的。     

重庆肉牛腹泻相关病毒的检测及遗传进化分析

为了解重庆市肉牛病毒性腹泻的病原流行情况,本研究对重庆市8个肉牛养殖场的81份腹泻粪便样本中牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCV）、牛轮状病毒（bovine rotavirus,BRV）和牛星状病毒（bovine astrovirus,BAstV）4种致腹泻病毒进行了RT-PCR检测,对PCR产物进行测序,用Mega 6.0软件进行系统发育分析。结果显示,BRV、BAstV和BVDV检出率分别为66.7%、8.6%和7.4%,BCV未检出。遗传进化分析结果表明,测序的5个BRV单独聚为一小支,与GenBank中其他VP6序列有明显的遗传距离;BVDV与中国株和丹麦株聚为一支,遗传关系最近;5个BAstV单独聚为一支,与中国香港株遗传关系最近,但仍有明显的遗传距离。本试验结果表明,重庆地区肉牛腹泻主要发生在6月龄以下犊牛,BRV是该地区肉牛腹泻的重要原因,BRV、BAstV和BVDV 3种病毒的遗传多样性值得进一步关注。