大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合基因表达条件的优化

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含K88ac-ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下K88ac-ST1-LTB融合基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,同时以IPTG为诱导剂诱导K88ac-ST1-LTB融合基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度1.0 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间3 h,此时K88ac-ST1-LTB融合蛋白表达量为35.2%。本文实现了K88ac-ST1-LTB融合基因的高效表达,并为大肠杆菌肠毒素三价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

棉籽饼脱毒菌剂的工业化生产工艺研究

为了研究棉籽饼脱毒菌株M-4菌剂的工业化生产工艺,试验采用单因素试验法和正交试验法对棉籽饼脱毒菌株M-4摇瓶发酵产芽孢条件进行优化,初步确定发酵培养基组分及培养条件,采用10 m3发酵罐发酵考察种子液培养方式与通气量等芽孢杆菌菌剂发酵生产工艺参数,并考察发酵液浓缩及菌体干燥工艺参数。结果表明:菌株M-4菌剂生产用培养基碳源为5.0 g/L蔗糖,氮源为10.0 g/L蛋白胨,无机盐为Mn SO4·H2O 1.0 g/L和Mg SO4·7H2O 0.5 g/L;培养条件为发酵时间72 h,发酵温度30℃,p H值7.2;种子液培养方式选择斜面菌悬液进罐方式,发酵过程通气量为1∶0.8 V/(V·min);碟片式离心机进料流速以0.5 m3/h为宜。闪蒸干燥工艺参数为进风温度130℃,料液比1∶1,进料速率80 kg/h,麸皮粉细度60目。以此工艺所得干燥菌粉含水量为3.02%,芽孢存活率为88.6%,含菌量达3.05×1010cfu/g。说明此为适宜的棉籽饼脱毒菌剂工业化生产工艺。     

抑制大肠杆菌K88的益生菌体外筛选

本研究以从断奶仔猪肠道分离的益生菌为试验菌株,将大肠杆菌K88和益生菌接种到体外培养的猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell-1,IPEC-1)中,测定培养2.5h上清液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,同时将益生菌和大肠杆菌K88体外混合培养2.5h,进行平板计数,统计大肠杆菌K88菌数的变化,筛选出可以抑制大肠杆菌K88的益生菌。试验结果显示,干酪乳杆菌和凝结芽孢杆菌能显著降低IPEC-1培养上清液中的LDH活性(P<0.05),降低大肠杆菌K88对细胞的损伤;凝结芽孢杆菌能降低DMEM培养基中大肠杆菌K88的生长速度,结合模拟制粒过程及胃肠道环境的耐高温、耐酸及耐胆盐研究进行综合分析,该凝结芽胞杆菌对大肠杆菌K88有较好的抑制作用且具有良好的耐高温、耐酸及耐胆盐性能,具有作为微生态制剂菌株的应用潜力。本试验建立了能够抑制大肠杆菌K88的益生菌体外筛选技术模型。     

一株枯草芽孢杆菌的鉴定及液体发酵工艺优化

从鸡肠道筛选出一株菌,命名为DY032,经16S r DNA分子鉴定和系统发育分析,该菌种为枯草芽孢杆菌。在摇瓶发酵条件下,采用单因素试验,对菌株DY032的培养基配方进行优化,确定了影响发酵液菌体数和芽孢数的5个因素,分别为淀粉、鱼粉、豆饼粉、MnSO_4·H_2O和CaCO_3,其适宜浓度分别为20、10、10、0.05、0.05 g/L,进一步通过L_(16)(4~5)正交试验确定以上5因素的最佳配比。为放大培养,在最优培养基基础上,利用10 L发酵罐,采用L_9(3~4)正交试验设计,以芽孢数为指标,对菌株DY032的培养温度、pH值、搅拌转速、通气量4个条件进行优化。结果表明:菌株DY032培养基最优配方为:淀粉16 g/L,鱼粉10 g/L,豆饼粉10 g/L,Mn SO4·H2O 0.05 g/L,Ca CO30.03 g/L。最优发酵罐培养条件为:培养温度37℃,pH值6.5,转速200 r/min,通气量5 L/min,最终芽孢数可达51.95×108cfu/m L。     

鸭大肠杆菌制苗用基础种子的建立及高密度发酵培养试验研究

从定型的优势血清型菌株中选择了2株,制备了基础种子,并对基础种子第1代、第10代和第13代的传代细菌的培养特性、免疫原性以及毒力进行了测定。结果证明,鸭大肠杆菌GX-5株和GX-21株的基础种子传至13代,其培养特性、免疫原性和毒力均不发生变化,表明这两个分离株是良好的疫苗生产菌株,为建立种子批提供了依据。本试验还进行了鸭大肠杆菌高密度发酵试验,获得了鸭大肠杆菌在马丁肉汤培养基中的最佳发酵条件,即发酵温度37.5 ℃,pH 7.4,初糖浓度10 g/L,补糖量为10 g/L,接种量为4%,通气量为1 L/L·min,搅拌转速为200 r/min,培养12 h后得到的发酵菌液浓度最高,D_{600 nm}值达到30.32。本研究为鸭大肠杆菌抗原的规模化生产奠定了基础,也为新疫苗的研制和开发提供了基础材料。     

复合饲用酶菌株A3产果胶酶的研究

本试验对黑曲霉A3菌株产果胶酶的液体发酵条件进行了初步研究。不同的碳源、氮源对产果胶酶均有影响,试验结果表明,该菌株产果胶酶较适培养基为:碳源为麸皮70 g／L和可溶性淀粉10 g／L、氮源为(NH4)2SO410 g／L和NH4NO3 3．5 g／L;诱导物以果胶20 g／L为最佳;适宜产酶条件为培养基起始pH 3．0,培养温度为25℃,发酵 72 h达到产酶高峰。     

基于地方分离B型诺维氏梭菌的产毒试验及羊羔疫菌苗的研制

以分离自青海省海晏县病死羊脏内的一株B型诺维氏梭菌株为研究对象,通过不同培养基、不同p H及不同培养时间等进行产毒比较试验证明,该菌在含1.0%葡萄糖培养基,p H 8.0~8.4,37℃培养72h产毒达最高点,平均可达2万MLD/m L,最高可达4万MLD/m L;利用该菌株制成羊黑疫单价疫苗,并以标准菌株菌苗作为对照,完成了家兔免疫攻毒、血清抗体测定;羊免疫血清抗体测定及高免血清的制备等试验。试验结果表明,该疫苗0.1m L免疫家兔21d,可抵抗200MLD(家兔最小致死量)毒素的攻击,是现用疫苗的2倍,0.1m L家兔免疫血清可中和300MLD(小白鼠最小致死量)的毒素,是现用疫苗的3倍,羊免疫14d,血清0.1m L可中和400 MLD(小白鼠最小致死量)的毒素,180d时血清0.1m L可中和50MLD的毒素,用此疫苗免疫家兔制备的抗血清每m L可中和160000MLD毒素。该菌株在筛选的培养基上具有良好的产毒性能,制备的羊黑疫疫苗免疫效果明显优于标准菌株菌苗,可作为羊黑疫疫苗生产用菌株。     

犊牛致病性大肠杆菌蜂胶佐剂灭活苗的研制和检验

将血清型O111k58、O119k69、O128k67、O44k74、O144k90和O126k676个大肠埃希氏优势菌株分别接种于肉汤培养基,37℃振荡培养18 h,纯检合格即为制苗菌种。分别将6个菌株接种于营养琼脂培养基,37℃恒温培养22 h,用生理盐水洗下菌苔,细菌计数,浓缩成含菌数200亿/mL的悬液,等量混合。经甲醛灭活,以蜂胶为佐剂,按一定比例配制成100亿/mL大肠杆菌的蜂胶佐剂灭活苗。经安全试验、免疫剂量试验、免疫效力和免疫持续期试验证明本疫苗安全、有效。免疫接种1 mL,试验兔即可获得坚强免疫力,80 d保护率为100%。     

一株瘤胃源产纤维素酶菌株的培养条件优化

山羊瘤胃内容物菌群中分离得到的一株产纤维素酶菌株T15,采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)进行优化。对菌株培养基成分碳源、氮源和金属离子进行优化时发现,6 g/L的葡萄糖为碳源和5 g/L的牛肉膏为氮源时,产生酶活力达到最高。培养基中添加0.03 mol/L的Ca~(2+),对菌株产生纤维素酶有促进作用。在最优发酵培养基成分为基础,对菌株T15的发酵培养温度、培养时间、培养pH条件和接种量等四因素、三水平进行正交试验,该菌株的产纤维素酶最优发酵条件:以9 mL为接种量,培养基pH值7,培养温度35℃和培养时间40 h,其产生酶活力达到26.76 U/mL;其中培养时间、接种量、培养温度、和培养基酸碱条件对菌株发酵产纤维素酶影响依次增大。     

猪肺炎支原体DJ-166株的分离鉴定

从山西某猪场采集疑似猪支原体肺炎肺组织病料,接种CH培养基培养,克隆纯化获得一株菌株。该菌株经PCR、培养特性、生化特性和血清学特性试验鉴定为猪肺炎支原体,命名为DJ-166株。该分离菌株在人工合成培养基上传8代稳定后,活菌计数达到108CCU/m L;菌液培养物气管注射猪后,致病性较弱;免疫原性试验证明该分离菌株具有良好的免疫原性,此结论为猪支原体肺炎疫苗的研究提供了必要条件。     

一株猪肺炎支原体的分离鉴定

从全国部分猪场采集到疑似猪支原体肺炎肺组织病料12份,提取DNA进行猪肺炎支原体PCR和多重PCR检测,将病料研磨后分离猪肺炎支原体,最终分离到1株疑似猪肺炎支原体;通过测序分析、形态观察、生化试验、血清学试验证实其为猪肺炎支原体。该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养活菌滴度达109CCU/m L;菌株有一定的致病性,免疫原性好,可作为疫苗备用菌株,该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎疫苗奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h蛋白原核表达条件的优化

为了提高猪囊尾蚴排泄分泌抗原（ES Ag）M13h蛋白基因在大肠杆菌中的表达量，试验研究了培养基、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对pET32a-M13h融合蛋白表达量的影响。结果：使用TB培养基于37℃培养3 h后，采用终浓度为0.4 mmol/L的IPTG在37℃、100 r/min诱导培养4小时时，pET32a-M13h融合蛋白表达量最大；SDS-PAGE检测结果表明pET32a-M13h融合蛋白的分子质量与预计大小一致，约为30 ku；Western-blot检测结果表明pET32a-M13h融合蛋白能与猪囊尾蚴多克隆抗体发生特异性反应。     

青贮用黄曲霉毒素降解菌株的产芽胞条件优化

[目的]利用正交试验设计对青贮用黄曲霉毒素降解菌株N-1a产芽胞条件进行优化。[方法]以菌株的菌体生物量和芽胞形成率作为考察指标,利用单因素试验和正交试验设计优化菌株N-1a的发酵用培养基组成和培养条件。[结果]优化后的N-1a最佳产芽胞培养基组成配比为：玉米粉2.0%,黄豆饼粉1.0%,MnSO4·H2O 0.10%,MgSO4·5H2O 0.01%;最佳产芽胞条件为：p H值为7.0,发酵时间48 h,接种量4%,装液量75 m L/250 m L培养基;在该条件下,N-1a的菌体生物量为6.08×10^8cfu/m L,芽胞形成率为81.25%。[结论]菌株N-1a的摇瓶产芽胞条件为其中试生产提供了实验依据。     

新生猪腹泻大肠杆菌K88K99双价基因工程疫苗

中国农科院哈尔滨兽医研究所的科研人员利用现代基因工程技术手段,人工构建出非产肠毒素性且具有K88 K99两种保护性抗原的大肠杆菌菌株,通过接种于适宜培养基发酵高密度培养,成功试制出了新生猪腹泻大肠杆菌K88 K99双价基因工程疫苗。该疫苗于1990年荣获中国农科院科技进步一等     

响应面法优化饲用屎肠球菌QW256增殖培养条件

为明确具有益生潜力的屎肠球菌QW256最适培养基与培养条件，利用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、中心组合设计试验以及响应面法探究不同碳源、氮源、营养因子以及培养条件对菌株屎肠球菌QW256活菌数的影响。结果表明：屎肠球菌QW256菌株最佳增殖培养条件为接种量5%、培养温度37 ℃、初始pH 7.8|最适培养基成分为糖蜜24.7 g/L、酵母粉10 g/L、玉米浆16 g/L、柠檬酸0.25 g/L、柠檬酸钠5.1 g/L、硫酸镁 0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L 。在优化后的培养基和培养条件下培养 17 h时活菌数达1.12×1010 CFU/mL，为其工业化应用提供了试验依据和技术支持。 [关键词] 屎肠球菌QW256|培养基|培养条件|活菌数     

鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌蜂胶二联灭活苗的研制与应用

广东省农科院兽医研究所黄承锋等,对鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌双联灭活苗进行了研制。将分离到的鸭疫里氏杆菌接种于 P－ L肉汤培养基中摇振培养 24 h后,进行纯度检验,取无杂菌污染菌种培养液接种于大瓶 P－ L肉汤培养基中培养 24 h,再进行纯检后加入甲醛灭活 48 h,取灭活菌液接种于巧克力培养基中以无菌生长为准。再有,将分离到的大肠杆菌菌株接种于牛肉汤培养基培养 24 h后,进行纯检作为种子液。取无杂菌种子液接种于大瓶牛肉汤培养基中培养 24 h,再进行纯检后加入甲醛灭活 48 h,取灭活菌液接种于普通琼脂培养基中,以无杂菌生…     

H5N1亚型禽流感病毒核衣壳蛋白原核表达条件的优化

为了提高禽流感核衣壳蛋白(NP)在大肠杆菌中的表达量,试验研究了载体、培养基、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对NP融合蛋白表达量的影响。结果:使用LB培养基于37℃培养3.5h后,采用终浓度为2mmol/L的IPTG在28℃、200r/min诱导培养5h,pET32a-NP融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-NP融合蛋白的分子质量与预计大小一致,约为70ku;Western-blot结果表明,pET32a-NP融合蛋白能与抗His标签的单克隆抗体发生特异性反应,说明NP蛋白得到正确表达。     

猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术研究

肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻,是疫苗规模化生产的工艺难题。本文针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术进行研究。通过培养试验筛选四种培养基配方表明该疫苗株在低血清改良培养基中生长良好;优化发酵培养工艺,使其在发酵罐培养60～70 h的峰值可达到1010CCU/mL;设计筛选该疫苗耐热保护剂和冻干工艺,37℃下保存10 d的耐老化试验结果显示,下降滴度小于100.5CCU/mL。本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。     

大肠杆菌菌苗的研制

对苗用菌株的灭活时间和菌苗免疫条件进行筛选的条件下,用甘肃省大肠杆菌的代表血清型和筛选的大肠杆菌原生质体融合菌株研制大肠杆菌菌苗,并进行菌苗安全性试验。正交试验试验结果表明:菌苗的最佳组合是抗原含量是4亿/mL和佐剂含量是10 mg/mL。苗用菌株的灭活试验结果表明:鸡苗的灭活条件是1%甲醛作用96 h;猪苗的灭活条件是2%甲醛作用48 h。     

A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α毒素突变基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确。同时以IPTG为诱导剂诱导α毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果是：培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%。从而实现了α毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。