猪乙型脑炎病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的研制及其应用

为研制一种快速猪乙型脑炎病毒抗体检测试剂盒，本研究参照已发表的JEV（乙型脑炎病毒）基因组序列，RT—PCR扩增了长约1000bp的E基因片段，连接pET30a表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白，以该蛋白作为诊断抗原，研制了检测乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA（酶联免疫吸附试验）诊断试剂盒。该试剂盒与其它7种常见猪病病毒（圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、蓝耳病病毒、细小病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒）的阳性血清不发生交叉反应；批内重复性试验的变异系数小于5％，批间重复性试验的变异系数小于10％；与HI（血凝抑制试验）相比，符合率、敏感性和特异性分别为83．1％、84.3％和80．0％。本研究制备的重组蛋白具有良好的反应活性，以其作为包被抗原研制的JEVE—ELISA诊断试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性，为JEV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和JEV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断试剂盒。     

乙型脑炎病毒EⅢ基因片段的表达与EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒,将乙型脑炎病毒EⅢ基因克隆至原核表达载体p ET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。以纯化后的重组蛋白EⅢ包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western bloting分析表明,重组蛋白分子质量约为30ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有来良好的免疫原性。优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为4.7μg/m L,血清样本的阳性临界值为0.255。特异性试验结果表明,重组蛋白与猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环病等多种病原体的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明,血清稀释至1∶6400时仍检测为阳性。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%。用该试剂盒检测224份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为90.7%。研究结果表明,原核表达的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ蛋白具有良好的免疫原性,研制的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,为猪流行性乙型脑炎的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别等方面提供了重要方法。     

间接 ELISA 试剂盒在猪乙型脑炎抗体检测中的应用效果评价

猪乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B）是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）引起的一种急性人兽共患传染病,猪主要特征表现为高热、流产、产死胎和公猪睾丸炎,感染率较高,发病率和死亡率较低,对国内养猪业和公共卫生都带来了巨大威胁。间接ELISA抗体检测方法具有价格低廉、操作简单、高通量、敏感性高、特异性强等优点,是猪乙型脑炎血清学抗体水平检测的主要方法。研究利用猪乙型脑炎间接ELISA抗体检测试剂盒对2012-2013年采集于山东、河南、河北等地的526份免疫猪血清样品进行了抗体检测,并进行了间接ELISA抗体检测试剂盒与乳胶凝集试验抗体检测试剂盒的符合率研究。旨在评价猪乙型脑炎间接ELISA抗体检测试剂盒的临床适用性及准确性,进而评价其临床应用效果,同时掌握我国猪乙型脑炎疫苗的群体免疫效果,了解我国部分地区猪乙型脑炎的免疫现状,为猪乙型脑炎的综合防控提供参考依据。     

流行性乙型脑炎多克隆抗体的制备及其囊膜E蛋白ELISA方法的建立

为了建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,试验用纯化的乙型脑炎病毒免疫健康新西兰白兔制备多克隆抗体,并对多克隆抗体进行纯化和效价测定;以纯化原核表达的乙型脑炎重组结构蛋白(E蛋白)为包被抗原,通过对检测方法相关条件的优化,建立了检测乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;在批内重复试验中,变异系数小于10%。     

检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

以乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗株作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立了检测猪乙型脑炎病毒血清抗体的间接ELISA方法。应用该法检测从江苏、安徽、山东、浙江4省部分地区收集到的1089份血样,对华东地区猪乙型脑炎血清流行病学进行初步调查。结果JEV抗体阳性率为68.2%,其中,种猪JEV抗体阳性率为82.1%,商品猪JEV抗体阳性率为62.6%。从中随机抽取135份血样与国产商品化试剂盒进行比较,间接ELISA方法的特异性和敏感性分别为92%和96.4%,2种方法的符合率为95.6%;与NS1蛋白包被建立的ELISA比较,两者的符合率为97.7%;同时,本法的阳性检出率显著高于临床普遍使用的乳胶凝集试验结果。由此表明,本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,适于大规模猪乙型脑炎血清流行病学调查。     

东莞市横沥镇猪流行性乙型脑炎血清学调查

为了解东莞市横沥镇猪流行性乙型脑炎流行情况,在2013~2015年,采用酶联免疫吸附方法,对采集的432份猪血清进行了流行性猪乙型脑炎抗体检测。结果为非免疫场100份血清,抗体阳性15份,抗体阳性率为15.00%;免疫场332份,抗体阳性250份,抗体阳性率为75.30%。结果表明,东莞市横沥镇猪场存在流行性乙型脑炎的感染,对于流行性乙型脑炎的防控需采取综合防控措施。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

为建立一种快速检测流行性乙型脑炎病毒抗体的方法,本研究参照已发表的JEV基因组序列,应用RT-PCR扩增了长约1000bp的E基因片段,连接pET30a表达载体中,经诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明其具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测流行性乙型脑炎病毒抗体的E-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为JEV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和JEV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

被动血凝(PHA)快速检测日本乙型脑炎抗体方法的建立

本文报道了快速检测日本乙型脑炎（乙脑）抗体的被动血凝方法。用PEG提纯乙脑BHK抗原致敏醛化绵羊红细胞可用于人、猪血清中乙脑抗体的检测．该方法具有较高的敏感性和特异性，实验结果表明：该方法与血凝抑制试验具有同等的敏感性，两者符合率为85．12％，与ELISA符合率为91．70％。     

猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为：抗原包被浓度为3.15μg/mL,待检血清稀释度为1∶40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性血清检测呈阴性反应。批间、批内试验变异系数均不超过8%。用该方法与HerdChek ELISA试剂盒同时对119份血清进行了平行检测,其相对敏感性、特异性和符合率分别为：75%、80.7%和79%。试验结果表明：猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病毒血清抗体检测。     

被动血凝（PHA）快速检测日本乙型脑炎抗体方法的建立

本文报道了快速检测测日本乙型脑炎（乙脑）抗体的被动血凝方法。用ＰＥＧ提纯乙脑ＢＨＫ抗原致敏醛化绵羊红细胞可用于人，猪血清中乙脑抗体的检测，该方法具有较高的敏感性和特异性，实验结果表明：该方法与血凝抑制试验具有同等的敏感性，两者符合率为８５．１２％，与ＥＬＩＳＡ符合率为９１．７０％。     

检测CSFV、JEV、PRRSV三种RNA病毒多重RT-PCR方法的建立

猪瘟病毒(CSFV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提。根据GenBank发表序列选取3对引物建立检测CSFV、JEV和PRRSV病毒的多重RT-PCR方法,扩增产物分别为508 bp、380 bp、263 bp。经与IDEXX商品化的检测CSW抗原试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;扩增JEV和PRRSV PCR产物分别经EcoR V和Sau3A I酶切得到预期的片段。建立的多重RT-PCR检测JEV、PRRSV和CSFV敏感度分别为12.5个TCID_(50)、10个TCID_(50)和10~(-3)ng总RNA。结果表明该多重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床三种病毒核酸的检测。     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用

本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。     

Development and evaluation of indirect ELISA for the detection of antibodies against Japanese encephalitis virus in swine

The Japanese encephalitis virus (JEV) is one of causative agents of reproductive failure in pregnant sows. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) was examined for its potential use in the rapid monitoring of the JEV, and the results were compared with those from the hemagglutination inhibition (HI) and serum neutralization (SN) tests. The comparative analysis showed that the results of I-ELISA showed a significant correlation with the conventional HI (r = 0.867) and SN tests (r = 0.804), respectively. When the I-ELISA results were compared with the traditional diagnostic assays, the sensitivity of the I-ELISA was 94.3% with the HI test and 93.7% with the SN test, respectively. The specificity was found to be 81.4% and 80.0% with the HI and SN tests, respectively. To determine the applicability of I-ELISA in the field, the serum samples from 720 pigs were collected from 4 regions in Korea between July and August 2004. The results indicated that 21.7% of screened pigs were seropositive for the JEV. The seropositive rates of JEV in the 4 provinces were 12.6% in Gyeonggi, 45.0% in Gyeongnam, 16.7% in Jeonbuk, and 12.2% in Jeju. The I-ELISA methodology developed in this study was shown to have considerable sensitivity and specificity through a comparison with HI and the SN tests. Therefore, it might be one of convenient methods for screening a large number of samples in various fields.     

乙脑病毒非结构蛋白NS1的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的初步建立

克隆表达乙脑病毒非结构蛋白NS1,并以其作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法。用此方法分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪圆环病毒(PCV)阳性血清各3份,以及33份健康非免疫仔猪血清和205份乙型脑炎灭活疫苗免疫的猪血清,评价NS1-ELISA方法的特异性。取54份乙脑病毒感染的猪血清进行NS1-ELISA检测,评价该方法的敏感性。NS1-ELISA检测的特异性为95%,敏感性达90.7%。与商品化试剂盒比较,其符合率达到96.0%。在重复性试验中,NS1-ELISA检测方法重复性较好。本试验为进一步研究不同感染时期NS1抗体水平的差异奠定基础。     

Serosurveillance for Japanese encephalitis virus infection among equines in India

The seroprevalence of Japanese encephalitis virus (JEV) among equines was evaluated from January 2006 to December 2009 in 13 different states of India by hemagglutination inhibition (HI) test and virus neutralization test (VNT). Antibodies against JEV were detected in 327 out of 3,286 (10%) equines with a maximum prevalence reported in the state of Manipur (91.7%) followed by Gujarat (18.5%), Madhya Pradesh (14.4%), and Uttar Pradesh (11.6%). Evidence of JEV infection was observed in equines in Indore (Madhya Pradesh) where a 4-fold or higher rise in antibody titer was observed in 21 out of 34 horses in November 2007 to October 2006. In March 2008, seven of these horses had a subsequent 4-fold rise in JEV antibody titers while this titer decreased in nine animals. JEV-positive horse sera had a JEV/WNV (West Nile virus) ratio over 2.0 according to the HI and/or VNT. These results indicated that JEV is endemic among equines in India.     

Quantitative and Qualitative Study of Enzyme-linked Immunosorbent Assay to Detect IgG against Japanese Encephalitis Virus in Swine Sera

This study was designed to investigate the application of indirect enzyme-linked immunoassay (ELISA) in detecting IgG against Japanese encephalitis virus in swine sera and the qualitative nature of this test. The attenuated strain SA14-14-2 of Japanese encephalitis virus (JEV) was inoculated into 9-day-old chicken embryos and virus was harvested, purified and suspended in 0.9% saline as JEV antigen. The control antigen was prepared by the same method as for the antigen. In the ELISA, the optimal concentrations of antigen coated and dilution factor were selected using chi2 test. Ninety-two swine sera negative to haemagglutination inhibition (HI) were tested by this assay and the positive threshold was determined. The results of this study indicate that indirect ELISA has high specificity, sensitivity and reproducability. Simultaneous testing of 74 serum samples from nine pig farms was carried out to compare the existing HI test and the indirect ELISA. The coincidence rate of the two assays was 85.1% (63/74) and no significant difference was observed between them (p > 0.05). This ELISA test can detect 46 swine serum samples qualitatively and the titre of eight swine serum samples through endpoint dilution quantitatively within one 96-well plate.     

PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确诊断猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪轮状病毒(RV)引起的猪腹泻病,通过设计三对引物,建立了扩增PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法,用于临床上大量腹泻病料的鉴定。该方法特异敏感,能同时检测PEDV、TGEV、RV,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型病毒、乙型脑炎病毒、猪细小病毒等无扩增,检测的抗原稀释极限为107。用于35个猪场120份临床样品的检测,PEDV阳性率占37.5%,TGEV阳性率占0.75%,RV阳性率占1.25%。PEDV阳性病料测序结果分析表明,与近几年分离毒株亲缘关系较近,与经典毒株和疫苗株亲缘关系较远。结果表明建立的多重PCR方法特异性强、敏感度高,能用于临床诊断及流行病学调查。