猪呼吸道上皮细胞的体外原代培养研究

为探索猪呼吸道上皮细胞体外的原代培养,对胶原酶Ⅳ+胰酶消化法、胰酶消化法、胶原酶Ⅳ和胰酶消化结合组织块培养法以及组织块培养法等4种分离细胞的方法进行了比较,同时比较了不同浓度胎牛血清的培养基所培养细胞的纯度及成活率,采用差速贴壁法纯化细胞并对所得的上皮细胞进行冻存复苏研究。结果表明:组织块培养法培养获得的细胞数量和纯度极显著高于胰酶消化法(P0.01),胶原酶Ⅳ+胰酶消化法获得的细胞成活率显著高于胰酶消化法;含有5%血清的培养基培养的细胞成活率及纯度均高于用10%血清培养(P0.01),冻存1个月后的细胞复苏率为85%。     

鸡传染性法氏囊病病毒快速适应鸡胚成纤维细胞的研究

将鸡传染性法氏囊病病毒的鸡胚组织毒或法氏囊组织毒直接在鸡胚成纤维细胞(CEF)上盲传3～13代后。能产生特征性细胞病变效应(CPE)。病毒在含65℃灭能30分钟的犊牛血清的细胞生长液制备的CEF上传代,比在含有56℃灭能的犊牛血清的生长液制备的CEF上传代能早3～5代出现CPE,而得到适应;鸡胚高代毒比鸡胚低代毒更易适应CEF;法氏囊组织毒和鸡胚低代毒对适应CEF的进程没有显著差异。     

利用血清冷冻保存犊牛睾丸原代细胞试验

在不利用冷冻保护剂的条件下,用犊牛血清对经胰酶消化分散的犊牛睾丸原代细胞进行超低温冷冻保存试验。结果表明,解冻后细胞成活率达75.73%以上,培养时可有效形成单层细胞,满足常规试验要求。复苏后的犊牛睾丸原代细胞于体外培养时存在贴壁迟缓,前期生长速度较慢等现象,且要求pH值低于7.0。     

猪痢疾密螺旋体液体培养的研究

本文参考了 J.M.Kinyon 和 D.L.Harris报道的酪蛋白胰酶消化汤,制备了胰胨豆胨琼脂液体培养基,用 A_2株和 B_3株致病性密螺旋体(T.h.)作接种试验,37℃厌氧培养,获得增菌成功。浅层培养比高层培养多1倍以上。培养3—6天,菌体短小活跃,8天左右是生长高峰期,每毫升菌数达10~7～10~8(菌落形成单位),培养基呈云雾状混浊,9天后菌体细长为多且活性减弱,23天后部分菌体膨胀、溶解。30天已不存活。培养过程 pH 值变化不大,从7.0降到6.4～6.5。从试验结果得知:胰蛋白胨、大豆蛋白胨、纯化琼脂和犊牛血清是液体培养基的极为重要成份,缺少其中之一,则大大影响 T.h. 的增殖;但红血球裂解液对 T.h.的增殖影响不显著。     

牛精原干细胞的分离和纯化及体外培养的一般特性

采用两步酶消化法制备5月龄的牛生殖细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,37℃,5%CO2饱和湿度培养,观察培养细胞的生长和形态变化。结果5月龄牛的曲细精管主要包含细胞为精原细胞、Sertoli细胞,每克睾丸实质收获生精上皮细胞总数平均为3.18×106个细胞,精原细胞纯化后纯度达69.27%,精原细胞主要分布于27%~35%的Percoll梯度中。牛精原干细胞体外培养6~7 d后开始分裂,20 d后精原干细胞形成小集落。结果表明用两步酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的精原细胞能满足体外培养的需要,可以存活并发生增殖。     

猪骨骼肌原代细胞培养方法的优化

猪骨骼肌细胞的原代培养在研究猪骨骼肌的发育和调控机制中发挥重要的作用。试验通过对不同的胰酶消化时间(10min,30min,60min)、离心转速(800r/min,1 000r/min,1 500r/min)以及首次换液时间(24h,36h,48h)分别进行比较和分析,培养适宜时间后观察细胞的形态、个数及贴壁成活率,筛选最佳的培养体系。试验结果显示在37℃下浓度为0.25%的胰酶消化30min,1 000r/min下离心5min,37℃恒温培养箱培养36h后对细胞进行首次换液,细胞贴壁状态和成活率最佳。研究结果为猪原代骨骼肌细胞的培养筛选了最佳的培养体系,并为猪骨骼肌生长发育机制的相关研究提供重要工具。     

鸡痘活疫苗抗原制备生产新旧工艺的比较

<正>在鸡痘活疫苗的抗原制备中,根据规程要求:鸡胚成纤维细胞的制备用0.25%的胰酶水浴消化25~35 min,玻璃珠摇撞制备细胞悬浮液,24 h形成致密单层后接毒,营养液为乳汉液,血清浓度为3%~6%。按此方法组织生产,出现CPE(特异性细胞病变)时间不规律,效价不稳定的现象。在本次试验中,试验人员采用磁力搅拌器和TV液(胰酶-ED-     

兽用生物制品生产用牛血清质量标准研究——牛血清对Sp2/0细胞增殖试验研究

为制定兽用生物制品生产用牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准,将处于对数生长期的Sp2/0细胞分散,配制成50万/mL细胞悬液,用含10%不同牛血清的MEM营养液,在96孔细胞培养板上作对倍稀释,在5%CO2培养箱37℃培养48 h,计数每种血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率。结果表明,胎牛血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率为20%-26%,犊牛血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率为12%-18%。以胎牛血清作为标准参考血清计算不同牛血清对Sp2/0细胞的相对克隆形成率,3批胎牛血清的相对克隆形成率均在80%以上,6批有效期之内的新生牛血清的相对克隆形成率为50%左右。因此,将兽用生物制品生产用胎牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准规定为对标准血清相对克隆形成率不低于80%;新生犊牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准规定为对标准血清相对克隆形成率不低于50%。     

新生Wistar大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定

本试验取新生24 h内的Wistar大鼠心肌组织,无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,逐日在倒置相差显微镜下观察。结果于培养后48 h即可观察到部分细胞搏动;72 h后,细胞逐渐展开,搏动频率在60~70次/min,从而初步确立培养的细胞为心肌细胞;进一步采用心肌细胞特异性蛋白(cTnT)抗体和α肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体分别对培养的心肌细胞进行免疫荧光及免疫组织化学鉴定,结果均呈阳性。     

小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究

建立小鼠输卵管上皮细胞原代培养及纯化方法.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用组织块培养法和酶消化法.酶消化法于37℃分为4个处理组进行.处理1以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA消化5、10、20 min;处理2以0.5 g/L胰酶+0.08 g/L EDTA消化35、50、75 min;处理3以0.3 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60、90、240 min;处理4以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA和0.3 g/L Ⅰ型胶原酶(1∶2)消化60 min,150 min.原代细胞纯化采用差速贴壁和反复差速贴壁法.传代采用胰酶两步消化法进一步纯化输卵管上皮细胞.组织块法原代培养成纤维细胞生长优势明显,传代纯化细胞效果不佳.用酶消化法原代培养时,处理1效果不理想;处理2采用3个消化时间时均取得比较理想的结果;处理3消化240 min时结果较好;处理4消化150 min效果较好.原代细胞纯化,反复差速贴壁得到的上皮细胞较纯,进一步传代纯化细胞取得了理想的结果.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用酶消化法结合反复差速贴壁分离纯化细胞,传代采用两步消化法,可以成功地进行小鼠输卵管上皮细胞的分离纯化培养.     

猪白细胞干扰素效价测定方法的探讨

1989年杨云楼等、1988年吴淑华等用人羊膜细胞(WISH)、猪肾原代细胞、猪肾传代细胞对比测定了猪干扰素及人干扰素的抗病毒活性,结果很接近,认为猪与人干扰素之间有较大同源性,并与1979年Carter的报道一致。参照前人的方法,我们反复探讨、摸索出猪白细胞干扰素效价测定方法,现报道于后。 1 攻击病毒(VSV:水泡性口炎病毒)的制备 1.1 选9～10日龄无鸡新城疫抗体的健康鸡胚,去头、内脏,用Hank's液洗一次,剪碎,加0.1％胰酶,37℃水浴消化20分钟,弃去胰酶液,用Hank's液再洗一次,加入生长液(含5％小牛血清的D—MEM     

一种简便有效的微量板处理方法

1．将用过的微量板及时弃去孔内培养物后,用0.1NNaHCO_3(也可用NaOH)将0.25%胰酶调成紫红色(因碱性环境促进细胞消化),每孔加20ul。(或用PBS将胰酶作对倍稀释后,每孔加30ul)加盖放入     

不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过不同的方法分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果.结果表明:组织块接种、0.25%的胰酶和100 u/mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3 h.可以得到大量细胞用于原代培养.在以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、100μg/mL的双抗、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠等,组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好.上皮细胞显微结构显示:奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中舍有不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈多角形,细胞之间连接成片,细胞界限明显,部分细胞界限不明显.     

应用酶联免疫吸附试验诊断牛肝片吸虫感染的研究

用肝片吸虫成虫制备部分纯化抗原,以10μg/ml浓度包被微量反应板,对疫区106份肝片吸虫感染牛血清、I7份正常牛血清及10份非疫区正常牛血清(1:200稀释)进行ELISA检测,以OD_(492)值大于非疫区正常牛血清OD_(492)值2倍为阳性标准(即>0.54)。结果表明,肝片吸虫感染牛血清的阳性检出率为81.1％,显著高于粪检虫卵的检出率42.4％(P<0.001)和琼脂凝胶双扩散试验的检出率65.1％(P<0.01)。疫区和非疫区正常牛血清的阴性符合率为100％、血清抗体的出现比虫卵的检出早2个月左右。据此认为,本法可用于本病的早期诊断和血清流行病学调查。     

仔猪心肌细胞分离及培养方法研究

为探讨仔猪心肌细胞的分离及培养方法,采用胶原酶Ⅳ型和胰酶同时消化心肌组织,用10%胎牛血清终止消化,并用100目细胞筛过滤后,1200 r/min离心沉淀细胞,再加入培养液重悬细胞。采用差速贴壁法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育。结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12~24 h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3~4 d后形成细胞簇,5~7 d后细胞汇合成片。因此,同时使用胶原酶Ⅳ型和胰酶消化仔猪心肌可简便、快速地获得高活力的心肌细胞。     

不同厂家胰酶制备鸡胚成纤维细胞对比试验

本试验用半胚法制备鸡胚成纤维细胞,用胰酶对SPF鸡胚进行消化培养,并观察所得细胞的生长情况。在相同条件下设立两个对照组,观察胰酶在细胞制备过程中对试验的影响,并比较不同厂家(Gibco和Difco)生产的胰酶在相同条件下对鸡胚消化情况及所得细胞生长情况的影响。     

测定牛血清中抗传染性牛鼻气管炎病毒抗体的酶联免疫吸附试验——Ⅲ.与细胞中和试验的比较

在诊断传染性牛鼻气管炎的血清学方法中,国内外学者们普遍认为微量细胞中和试验比其它方法准确,但它远不如新近发展起来的酶联免疫吸附试验(ELISA)简便、快速和经济。在灵敏度和特异性方面,学者们也曾进行过比较。本文将进一步比较这两种方法的特异性,灵敏度以及它们之间的相关性。材料和方法病毒:制备ELISA抗原和微量细胞小和试验所用的病毒为Bartha Nu/64 IBR弱毒株。将含10%犊牛血清的病毒培养物冻融三次后,用3,000rpm离心15分钟,上清液小量分装后贮存在-70℃备用。     

猪卵母细胞在玻璃化冷冻液中的培养效果

本试验的目的是要选择较好的用于猪卵母细胞玻璃化冷冻的玻璃化冷冻液，玻璃化液由ＴＣＭ－１９９、ｍＰＢＳ、Ｋｉｅｖ液分别加２０％的犊牛血清与３种抗冷冻剂（丙三醇、１，２──丙二醇和乙二醇）组成。猪卵母细胞采自屠宰厂的卵巢并培养在ＴＣＭ－１９９＋２０％犊牛血清、ｍＰＢＳ＋２０％犊牛血清和Ｋｉｅｖ＋２０％犊牛血清中，在３７℃、湿度１００％条件下培养至少５个小时。５小时后逐渐加入抗冷冻剂，使其终浓度达５０％。培养５分钟后，将猪卵母细胞依次移至抗冷冻剂浓度为２５％，１２．５％和０％的培养液中，培养５分钟，而后进行台盼蓝死活染色。结果表明猪卵母细胞在各组培养后的存活率没有显著性差异（Ｐ＞０．０５），但乙二醇结果优于其它抗冷冻剂，而ＴＣＭ－１９９好于其它两类培养液。     

牛血清中非特异性抑制因子对几种病毒的抑制作用

犊牛和成牛血清对鸡传染性法氏囊炎病毒 D_(78)株(IBDV D_(78))的蚀斑形成抑制率在80%以上;对猪细小病毒的血凝抑制(HI)效价在32倍以上;对禽流感抗原的 HI 效价在64倍以上。胎牛血清对 IBDV D_(78)的蚀斑形成平均抑制率只有18.5%;对猪细小病毒及禽流感病毒的 HI 效价与成牛血清相同。成牛二血情(86-6号)经60℃30分钟、肝素·氯化镁、高碘酸钾处理后,对 IBDV D_(78)的蚀斑形成平均抑制率与处理前相比差异不显著;经65℃30分钟、丙酮、乙醚、受体破坏酶(RDE),高岭土处理后,对 IBDV D_(78)蚀斑形成抑制率较处理前显著降低,成牛血清经高岭土和胰酶处理后,对禽流感和猪细小病毒的 HI 效价消失;经乙醚、丙酮和 RDE 处理后,对禽流感病毒的 HI 效价降到32倍,对猪细小病毒的分别降到16倍和24倍;经65℃30分钟处理后,对猪细小病毒的 HI 效价仍为32倍,对禽流感病毒则升高到85.3倍.     

猪瘟细胞活疫苗细胞制备中分散液消化试验

本试验用犊牛睾丸细胞制备猪瘟细胞活疫苗,结果表明,EDTA胰酶加0.4%粉红消化细胞的病毒收获液检测兔子体温效果最好。