“高热病”病猪嗜麦芽窄食单胞菌的分离鉴定

从"高热病"猪的鼻液、支气管和肺组织分泌物的11份病料中,按常规方法进行病原菌分离鉴定,经亚胺培南分离筛选到7株疑似细菌.通过生化试验、16 S rDNA基因序列分析等,鉴定出其中2株为嗜麦芽窄食单胞菌(命名为PSM-1、PSM-2).与GenBank中临床和环境中分离的嗜麦芽窄食单胞菌分离株相比,两株菌的16 S rDNA基因扩增片段的核苷酸序列同源性均在99%以上.动物试验证实,2株细菌具有一定致病性;药敏试验表明,分离菌株对大多数抗生素具有较强耐药性且呈现多重耐药性.     

猪源嗜麦芽窄食单胞菌16 S rRNA基因的克隆和序列分析

从临床病猪无菌采集抗凝血，抽提全血基因组DNA，用能够扩增大多数真细菌16 S rRNA基因的通用引物，扩增出长度为1502bp的嗜麦芽窄食单胞茵的16 S rRNA基因；该基因与国外报道的嗜麦芽窄食单胞茵部分临床和环境分离株核苷酸序列的同源性达99％以上。证实嗜麦芽窄食单胞菌可感染猪。     

致病性嗜水气单胞菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank已登录的致病性嗜水气单胞菌保守序列16S rDNA和Aero,设计2对引物,以嗜水气单胞菌纯培养物为起始材料,建立PCR检测方法。从12株分离物中均扩增到16S rDNA片段,从3株分离物中均扩增到Aero片段,经序列测定和分析,所扩增的片段均为嗜水气单胞菌的核苷酸序列。结果表明,建立的PCR方法可用于检测致病性嗜水气单胞菌。     

疑似草鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

试验对疑似嗜水气单胞菌草鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织进行嗜水气单胞菌的分离鉴定。通过普通营养琼脂、胰蛋白大豆琼脂及生化试剂等的分离培养与生化鉴定后,获得3株细菌;16S rRNA通用引物检测3株细菌的基因序列比对确定菌株后,对确定的草鱼嗜水气单胞菌进行回归试验确认其致病性,然后采用临床上常用的阿奇霉素、阿米卡星、链霉素等10种抗生素进行药敏试验。结果表明,经过分离培养、生化鉴定及16S rRNA通用引物鉴定后确定3种菌株分别为嗜水气单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和腐败斯瓦尼菌,确定的嗜水气单胞菌回归试验证明其具有致病性;药敏试验显示阿奇霉素对腐败斯瓦尼菌和嗜麦芽窄食单胞菌敏感,其抑菌直径分别为105、95 mm,阿米卡星对嗜麦芽窄食单胞菌、嗜水气单胞菌和腐败斯瓦尼菌这3种菌都较敏感,抑菌直径分别为105、95和93 mm。结果表明,疑似为嗜水气单胞菌病的草鱼有3种细菌感染,其中鉴定的嗜水气单胞菌是致病菌,常用抗生素阿米卡星对3种菌都有抑制作用,而仅对腐败斯瓦尼菌和嗜麦芽窄食单胞菌敏感的是阿奇霉素。     

从山羊鼻内腺瘤病例中分离出嗜麦芽窄食单胞菌的报告

对临床发病的山羊病例进行尸体剖检、病理学诊断和细菌学检查,分析疫病发生的原因。根据尸体剖检和病理学检查诊断为山羊鼻内腺瘤病,并继发有严重的细菌感染。根据细菌分离培养、染色特性、生理生化特性及16S rDNA序列分析鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌。     

猪呼吸道疾病综合征主要致病菌的分离鉴定

对3个猪场的4头呼吸道疾病综合征病猪肺脏(猪场分别编号A、B、C,其中猪场A 1头、猪场B 2头、猪场C 1头)进行猪肺炎支原体(Mhp)、副猪嗜血杆菌(Hps)和猪胸膜肺炎放线杆菌(App)PCR检测,进而进行细菌的分离鉴定和药敏试验。结果显示:4份病料中App和Mhp均为阴性,Hps在猪场A和C的病料中为阴性,猪场B病料中为阳性;在猪场A分离出奇异变形杆菌和猪链球菌各1株;猪场B分离出1株化脓隐秘杆菌、1株嗜麦芽窄食单胞菌和1株奇异变形杆菌;猪场C分离出1株化脓隐秘杆菌和1株奇异变形杆菌。药敏试验结果显示:化脓隐秘杆菌对诺氟沙星、洛美沙星敏感,嗜麦芽窄食单胞菌对恩诺沙星敏感,奇异变形杆菌对诺氟沙星、恩诺沙星敏感,猪链球菌对诺氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、氧氟沙星敏感。小鼠致病性试验结果表明:变形奇异杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和化脓隐秘杆菌均能使小鼠出现一过性精神萎靡;猪链球菌引起试验小鼠全部死亡,具有较强致病力。     

16S rDNA序列分析法鉴定鸡源肠道乳酸菌

从北京郊区某散养鸡场健康成年鸡肠道中分离纯化得到12株未知菌,分别提取DNA,采用16S rDNA扩增通用引物,经PCR扩增后,测定其16S rDNA序列,测序结果与Gen Bank数据库中的序列作对比,根据序列相似性,利用MEGA软件,对12株未知菌序列构建进化树。经鉴定5株为乳酸杆菌、3株为唾液乳杆菌、2株为肠球菌、1株为罗伊氏乳杆菌及1株为葡萄球菌。结果表明,16S rDNA序列分析技术与传统方法相比具有简便和快速等优点,提高鉴定效率,可进行乳酸菌种级水平鉴定,适合用于实验室内对乳酸菌的鉴定。     

牛瘤胃微生物的分离鉴定与生化特性分析

【目的】 通过对瘤胃液中分离所得的菌株进行研究，为益生菌制剂的制备提供基础数据。【方法】 采集10头健康荷斯坦奶牛的瘤胃液，通过涂布、特性培养、纯化等步骤获得单一菌株，提取细菌DNA，进行16S rDNA的PCR扩增。通过16S rDNA基因测序鉴定后进行序列比对并构建系统发育树，确定菌株种类。对不同种类的细菌进行0~48 h的培养测定其生长特性，并进行耐酸碱和耐胆盐试验。【结果】 通过涂布分离菌株得到20株分离菌，经PCR扩增后测序发现20株菌属于7种不同的菌，大致确定L7为解淀粉芽孢杆菌、K7为枯草芽孢杆菌、S7为嗜麦芽窄食单胞菌、C2为地衣芽孢杆菌、M7为马链球菌、F7为弗氏酸柠檬杆菌、T7为吉氏库特菌。通过生长曲线可以看出，7株菌分别在24~36 h达到最快生长期。M7和K7对酸有较强的耐受性，而S7、C2和F7对酸性较为敏感，C2对碱的耐受性最强，而T7对胆盐的耐受性最强，S7对胆盐最不耐受。【结论】 本研究从瘤胃中分离得到的7个菌株对酸碱和胆盐具有不同程度的耐受性，以及最适生长周期。     

鱼源山梨醇发酵阳性温和气单胞菌的分离与鉴定

从鲫鱼肠道中分离出1株细菌,暂时编号为SR-1,进行细菌形态学观察、理化特征、16S rDNA序列分析及药敏试验等研究,结果表明SR-1菌株为山梨醇发酵阳性的温和气单胞菌;PCR扩增SR-1菌株的16S rDNA序列为1509 bp;BLAST比对分析结果表明SR-1菌株与温和气单胞菌(Aeromonas sobria)亲缘关系最近,序列同源性为99.87%～100%;药敏试验结果显示SR-1菌株对阿奇霉素、氯霉素、四环素、诺氟沙星、头孢噻肟、头孢克肟等药物敏感。     

一株益生芽孢杆菌Pab02的16S rDNA测序鉴定

利用16S rDNA分析对Pab02芽孢杆菌型益生菌进行系统进化鉴定.首先提取菌株Pab02的基因组DNA,根据不同种属细茵的16S rDNA序列两端的保守性设计通用引物,对茵株Pab02的16S rDNA的进行PCR扩增,并对扩增到的目标片段进行测序.将测序结果与NCBI上已知茵种的16S rDNA序列进行BLAST对比,初步构建系统进化树进行分析,再结合传统的形态观察及生理生化特性综合鉴定.最终确定为枯草芽孢杆菌.     

禽大肠杆菌的分离与16S rRNA的鉴定

从疑似患有大肠杆菌病的病死鸡群中采取粪便样品,分离病原进行生化鉴定,从8份样品中分离鉴定出6株大肠杆菌。根据细菌16S rRNA 基因的高度保守性,设计合成大肠杆菌的共同引物,对随机选取的1株细菌进行PCR扩增,并与GenBank中的E.coli 16S rRNA进行序列比对,确定这株细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌提供了一种简单、容易操作的手段。     

大肠杆菌铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与序列测定

试验以E.coliMG1655的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增sodC基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacI和KpnI酶切及PCR扩增鉴定,并对sodC基因片段进行序列测定。试验成功克隆了sodC基因,获得的基因与报道的sodC基因序列同源性达到99.6%,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

小鼠隐藏管状线虫线粒体cox1基因的扩增及序列分析

对从试验小鼠体内分离的蛲虫样品PMZ1-5的线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基（cox1）的部分基因（pcox1）进行PCR扩增、测序及序列分析,并与网上相关序列进行比对分析,研究其线粒体pcox1基因遗传变异情况。结果表明,获得pcox1有效序列373 bp,经序列比对分析,发现5个蛲虫样品之间的变异很小,只有1个碱基的差异,序列相似性为99.73%～100%,BLAST分析结果表明为隐藏管状线虫,与同属的Syphacia montana序列差异性为5.24%～5.68%。结果表明,隐藏管状线虫的pcox1序列种内变异很小,种间差异明显,本结果为进一步研究蛲虫的群体遗传学奠定了基础。     

菲莱氏温扬球虫18S rDNA基因的扩增与克隆分析

菲莱氏温扬球虫是鸭球虫病的重要病原之一,为了寻找种特异性的遗传标记,本研究采集广东省某鸭场的新鲜鸭粪,通过Sheather’s蔗糖漂浮法收集球虫卵囊,经形态学鉴定为菲莱氏温扬球虫;提取该球虫DNA样品,经过PCR扩增,首次获得了该虫的18S rDNA基因部分片段;对该基因进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系。结果显示,对菲莱氏温扬球虫序列与艾美耳科其他球虫关系较近,系统进化树分析属于艾美耳科的另一分支。表明18S rDNA基因在鸭菲莱氏温扬球虫的分类鉴定上是一种有效的分子标记。     

鸡源大肠杆菌AmpC型β-内酰胺酶的分子检测

为了解河南地区AmpC型β-内酰胺酶耐药基因在产16S rRNA甲基化酶鸡大肠杆菌的流行与分布,分别设计特异性引物对2005—2008年在河南地区病鸡的病料中分离保存的158株16S rRNA甲基化酶阳性鸡大肠杆菌进行聚合酶链式反应扩增。检测结果显示,在158株产16S rRNA甲基化酶鸡大肠杆菌中,CMY-2和DHA-1检出率分别为34.8%和36.1%。提示AmpC型β-内酰胺酶耐药基因在河南地区产16S rRNA甲基化酶鸡大肠杆菌中普遍存在。      

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。     

猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

从一例肝、肺化脓性结节,脾出血性肿大的病猪体内分离到一株革兰氏阳性、细长、形态不规则的杆菌,该菌在TSA平板、普通绵羊血琼脂、巧克力平板上生长缓慢,在普通绵羊血琼脂上呈α-溶血。对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、测序、比较,结果显示该菌与化脓隐秘杆菌的16S rDNA有99%的同源性,进一步用API生化鉴定,结果也与其相符。该菌在24~52 h内100%致死小白鼠,腹腔接种新西兰兔,接种兔72 h内死亡,表明该菌为致病性细菌。     

植物乳杆菌α-半乳糖苷酶基因（melA）的克隆与序列分析

试验以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增α-半乳糖苷酶基因（melA）基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacⅠ和Sph Ⅰ酶切及PCR扩增鉴定,并对melA基因片段进行序列测定。结果表明,测得的melA基因序列全长2240 bp,含有酶切位点、启动子、SD序列及编码738个氨基酸的开放阅读框,理论分子质量为84 ku;4种核苷酸中GC含量为47.45%、AT含量为52.55%;序列中有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变;序列测定结果与GenBank中登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性除与AY873840相比分别为96.6%和92.2%外,其余均大于99%。试验成功克隆了melA基因,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18 T Vector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌;Real-time PCR;标准曲线;