4株猪圆环病毒2型凉山州分离株全基因组进化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)凉山州分离株的基因型,本研究采用PCR方法对采自凉山州3个发病猪场的4个PCV2阳性样品进行全基因组序列的扩增、克隆、测序分析,并绘制遗传进化树。结果显示:4个PCV2凉山州分离株全基因组序列长度均为1767 bp,核苷酸同源性为99.4%~99.8%,与国内外101株PCV2参考毒株核苷酸同源性为93.8%~99.9%,与4个PCV2国产疫苗株核苷酸同源性为95.1%~96.0%;4个分离株ORF1和ORF2基因核苷酸同源性分别为99.3%~99.8%和99.6%~100%;构建的系统进化树显示,4个分离株均为PCV2d亚型,与YA1株(四川雅安,MH094769)的亲缘关系最近。本研究为凉山州PCV2疫苗毒株的选择提供了科学依据。     

3株猪Ⅱ型圆环病毒的分离及基因组序列分析

为了解混合感染中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2009年与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的病料中分离的3株PCV2通过PCR、免疫荧光等进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar对序列进行拼接和分析。结果表明:分离得到的HUN-09株(GQ449670)、HUB-09株(GQ449671)和SD-09株(GQ449669)3个PCV2毒株其全基因组长度均为1768bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为95%～99.7%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为97.6%～98.5%,与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69%～70%。进化分析表明,本研究2009年分离的3株PCV2属于基因型PCV-2a。     

猪圆环病毒2型辽宁株全基因组克隆与序列分析

本试验从辽宁地区某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中采集病料,采用PCR方法进行猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的检测,在此基础上对阳性病料进行PCV2全基因组克隆和序列分析。结果表明,PCV2辽宁分离株基因组全长为1768 bp,与国内外PCV2分离株的同源性为95.9%~99.5%,其中与丹麦分离株(EF565365)、澳大利亚分离株(AY424405)和江苏分离株(FJ158606)同源性最高,均为99.5%;与广东分离株(JX912915)同源性最低,为95.9%。     

云南省部分猪场病料猪圆环病毒3型PCR检测及克隆测序

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在云南省的流行及遗传进化情况,2020年10—12月收集云南省部分猪场疑似病料共24份,采用PCR方法进行PCV3病原检测;选取PCV3阳性扩增产物进行克隆测序,并将测序结果与16株国内外参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果显示:24份病料样品中检出阳性5份,阳性检出率为20.8%;克隆出的阳性扩增产物(YNJS-2020)ORF2核苷酸序列和国内外参考毒株的同源性较高,为97.4%～98.9%,其中与西班牙毒株MF80572000同源性最高,与安徽14-201611毒株同源性最低。结果表明,云南省存在PCV3流行,且流行毒株与国内外其他毒株遗传关系较近,但也有一定差异。结果提示,云南省应加强对PCV3的监测及其流行的控制,避免PCV3大面积流行。本研究为云南省PCV3基因型分析和疫苗研究提供了一定的数据基础。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株(Y16155-1株)的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6h即可检出PCV2核酸,72h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10-4.3 TCID50/0.2mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

福建省新发猪圆环病毒3型流行病学调查及遗传变异分析

猪圆环病毒3型(PCV3)是新发现的一种猪圆环病毒,该病毒可以引起猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍和全身多器官的炎症反应。为了解福建省PCV3流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律,本研究采集福建地区规模化猪场120份临床表现繁殖障碍和呼吸道疾病的组织样品,采用PCR方法对其进行PCV3检测。结果显示福建省猪场PCV3的感染率为12.5%。对福建省5株PCV3全基因组进行序列分析,结果显示,5株PCV3间核苷酸同源性为98.2%~99.6%,与国内PCV3分离株的核苷酸同源性为97.6%~100%,与美国分离株(PCV3-US/MO2015、PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016、PCV3 2164和PCV3 29160)的核苷酸同源性为97.8%~99.3%,而与PCV2的核苷酸同源性为43.8%~44.1%,与我国蝙蝠圆环病毒的核苷酸同源性为49.2%~51.1%。PCV3系统进化树结果显示,福建省5株PCV3处于3大亚群,1株属于3a亚群,1株属于3b亚群,3株属于3c亚群。其氨基酸序列分析显示PCV3 Cap蛋白比较保守,仅存在个别位点的氨基酸突变。本研究为福建省PCV3的分子流行病学、疫苗研究和有效防控提供实验依据。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪圆环病毒2型2015JS株的分离鉴定及全基因序列分析

采用细胞传代法对PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料进行病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)对分离的病毒进行初步鉴定,应用IFA测定分离株的TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性和系统进化分析。结果:成功分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1 766 bp,命名为2015JS株,分离株在细胞上的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(Gen Bank登录号KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型;与丹麦PCV2c毒株DK1980PMWSfree(Gen Bank登录号EU148503)的同源性最低(94.3%)。研究结果为江苏PCV2流行病学的研究和遗传变异的防控提供了参考资料,也为江苏PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

猪圆环病毒2型湖南株的分离及全基因组序列分析

为了解湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)的来源及与其他地区毒株的关系,从湖南省疑患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMW S)猪群中分离PCV2毒株1株(PCVHunan),提取病毒DNA,进行PCR扩增,扩增产物经克隆与酶切鉴定,获得1.7 kb片段的阳性重组质粒,对其进行全基因组测序分析,与Genbank中已知全基因组序列进行同源性比较。结果,该序列与国内外毒株核苷酸同源性为93.0%~97.7%,其中与美国株(AR145609)及澳大利亚株(AY424405)同源性最高,为97.7%。2个主要阅读框(ORF1与ORF2)氨基酸序列与国内外毒株同源性分别为98.4%~99.4%和88.0%~95.7%。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株（Y16155-1株）的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6 h即可检出PCV2核酸,72 h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10^-4.3 TCID₅₀/0.2 mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析

参考GenBank发表的PCV-2全基因组序列,设计1对引物,通过反向PCR技术扩增出6株PCV-2流行株的全基因,并进行了序列测定分析。结果表明,6个分离株基因组全长为1 768 bp或1 767 bp,同源性比较发现,分离株之间的核苷酸同源性为95.5%~100%,与GenBank上已发表的PCV-2分离株之间的同源性为93.0%~100%,与法国分离株同源性最高。6株分离株的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100%和92.3%~100%,存在较大的变异。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

Genetic diversity of porcine circovirus type 2 (PCV2) in the Romanian wild boar population

In this study, we have analyzed 23 PCV2 ORF2 sequences recovered from wild boar population in Romania. The PCV2 sequences were originated from different geographical regions in Romania, and collected between 2008 and 2009 during the classical swine fever virus (CSFV) surveillance campaign. Complete open reading frame 2 (ORF2) nucleotide sequences were obtained and compared with sequences mainly from European and Asian isolates. The Romanian sequences were identified as belonging to previously described clusters 2a and 2b, with high degree of heterogeneity (PCV2 ORF2 nucleotide homology ranged between 90.1% and 100%). Interestingly, for cluster 2a, the majority of the sequences (8 from a total number of 9) clustered mainly with the Asian isolates (especially China, but also India and South Korea), with three exceptions from Europe previously reported in Germany, Belgium and The Netherlands.     

Genetic diversity of porcine circovirus type 2 (PCV2) in the Romanian wild boar population

In this study, we have analyzed 23 PCV2 ORF2 sequences recovered from wild boar population in Romania. The PCV2 sequences were originated from different geographical regions in Romania, and collected between 2008 and 2009 during the classical swine fever virus (CSFV) surveillance campaign. Complete open reading frame 2 (ORF2) nucleotide sequences were obtained and compared with sequences mainly from European and Asian isolates. The Romanian sequences were identified as belonging to previously described clusters 2a and 2b, with high degree of heterogeneity (PCV2 ORF2 nucleotide homology ranged between 90.1% and 100%). Interestingly, for cluster 2a, the majority of the sequences (8 from a total number of 9) clustered mainly with the Asian isolates (especially China, but also India and South Korea), with three exceptions from Europe previously reported in Germany, Belgium and The Netherlands.     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in The Netherlands

Pigs with wasting syndrome were examined for macroscopic and histopathological lesions, and for porcine circovirus (PCV). Histopathological lesions were comparable to those previously documented for post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). In addition, in seven out of ten examined PMWS-affected pigs focal-to-slight mononuclear meningitis and focal cerebral mononuclear infiltrates (4 out of 10) were observed. A virus was isolated from organs and sera from pigs showing wasting syndrome. An immunoperoxidase monolayer assay and an indirect immunofluorescence assay were performed on the infected PK-15 and Dulac cell cultures, respectively, and both assays indicated the presence of PCV type 2 (PCV2). The nested-polymerase chain reaction (nPCR) technique, based on the use of PCV2 specific oligonucleotides, revealed specific amplified products of 481 bp. Nucleotide sequence analysis of the entire genome of the Dutch PCV isolate 24657 NL showed a homology with known nucleotide sequences of porcine PCV type 1 (PCV1) and PCV2 isolates of 77.1% and >96%, respectively. This is the first report of the isolation and characterization of PCV2 in PMWS-affected pigs in the Netherlands.     

吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post‐weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands

Summary

Pigs with wasting syndrome were examined for macroscopic and histopathological lesions, and for porcine circovirus (PCV). Histopathological lesions were comparable to those previously documented for post‐weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). In addition, in seven out of ten examined PMWS‐affected pigs focal‐to‐slight mononuclear meningitis and focal cerebral mononuclear infiltrates (4 out of 10) were observed. A virus was isolated from organs and sera from pigs showing wasting syndrome. An immunoperoxidase monolayer assay and an indirect immunofluorescence assay were performed on the infected PK‐15 and Dulac cell cultures, respectively, and both assays indicated the presence of PCV type 2 (PCV2). The nested‐polymerase chain reaction (nPCR) technique, based on the use of PCV2 specific oligonucleotides, revealed specific amplified products of 481 bp. Nucleotide sequence analysis of the entire genome of the Dutch PCV isolate 24657 NL showed a homology with known nucleotide sequences of porcine PCV type 1 (PCV1) and PCV2 isolates of 77.1% and >96%, respectively. This is the first report of the isolation and characterization of PCV2 in PMWS‐affected pigs in the Netherlands.     

我国部分地区猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解我国猪圆环病毒2型(PCv2)流行毒株遗传变异情况,本研究对本实验室分离到的19株PCV2分离株通过病毒全基因组克隆和测序分析,将其分为2个大基因群和3个亚群,其基因组分别为1 766 nt、1 767 nt和l 768 nt,各占15.8%、73.7%和10.5%.以1 767 nt毒株为基准,其基因组第39或1 039位有1个碱基缺失后突变成1 766 nt毒株;第1 040位有1个碱基插入后突变成1 768 nt毒株.对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705 nt和708 nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸增加.同时,本实验选用Acc I和Fba I内切酶对19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,其结果可作为流行毒株分型鉴别依据.