鸡痘病毒诱发细胞融合现象的观察

鸡痘病毒在鸡胚绒毛作囊膜及鸡胚成纤维细胞上交替传代后，用本试验提供的条件，可以明显诱发鸡胚成纤维细胞的融合，形成多量多核细胞。经鸡胚及实验鸡回归试验证实，这种细胞融合现象确系鸡痘病毒所为。     

鸡传染性喉气管炎活疫苗生产工艺的改进——鸡胚绒毛尿囊膜渗透法接种应用实验

采用鸡胚绒毛尿囊膜渗透法给鸡胚接种病毒,收获感染的鸡胚绒毛尿囊膜制备鸡传染性喉气管炎活疫苗,相比于传统的人工气室绒毛尿囊膜接种法和尿囊腔接种法可降低鸡胚的早死亡率,提高鸡胚利用率,降低生产成本,提高单产量。     

鸡传染性喉气管炎病毒培养特性的研究

本试验从发病鸡群分离一株鸡传染性喉气管炎病毒(命名为NM98a)，并用分离株和ILT王岗株对鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚尿囊腔及鸡胚肾细胞上培养进行比较研究。结果表明：ILTV经不同途径接种鸡胚和鸡胚肾细胞上培养，在鸡胚绒毛尿囊膜和鸡胚肾细胞上引起的病变不同，但最终增殖达到的感染性病毒量没有明显区别。鸡胚尿囊腔接种是ILTV增殖最佳途径。     

鸡全胚成纤维细胞在鸡痘细胞活疫苗生产中的应用

采用鸡胚全部组织(全胚法)制备鸡胚成纤维单层细胞和采用鸡胚部分组织(常规法)制备鸡胚成纤维单层细胞生产了鸡痘细胞活疫苗,接毒后均产生大量的感染多核细胞和典型细胞融合性病变(胡椒粒样).鸡胚效价检测表明,鸡痘细胞苗和鸡痘组织苗均可引起鸡胚绒毛尿囊膜水肿、增厚或痘斑,但鸡痘细胞苗产生痘斑数量明显高于鸡痘组织苗.鸡体刺种结果表明,鸡痘细胞苗诱发的免疫反应(发痘)好于鸡痘组织苗;与常规法相比,全胚成纤维单层细胞制备方法可提高鸡胚利用率2倍以上.全胚法也可应用于制备其他鸡成纤维细胞疫苗.     

鸽痘病毒在鸡胚上的增殖和纯化研究

通过实验建立了鸽痘病毒的鸡胚绒毛尿囊膜和鸡胚尿囊腔培养方法,并对这两种方法的病毒收获量进行了比较研究.结果表明:这两种培养方法实用易行,实验所收集的病毒可以满足电子显微镜观察、核酸分析等科研及疫苗生产的需要.为鸽痘病毒的深入研究提供有利的试材.     

鸽痘病毒在鸡胚上的增殖和纯化研究

通过实验建立了鸽痘病毒的鸡胚绒毛尿囊膜和鸡胚尿囊腔培养方法，并对这两种方法的病毒收获量进行了比较研究。结果表明：这两种培养方法实用易行，实验所收集的病毒可以满足电子显微镜观察、核酸分析等科研及疫苗生产的需要。为鸽痘病毒的深入研究提供有利的试材。     

鸡新城疫与鸡痘二联活疫苗的研究

目前,我国各兽药生物制品厂所生产的鸡痘活疫苗一般分为两种,一种是鸡痘组织苗,即在鸡胚绒毛尿囊膜上接种鸡痘种毒,接种后120小时收获其增厚、水肿和有痘斑的全部绒毛尿囊膜制备的鸡痘苗,另一种则是鸡痘细胞苗,在免疫原性上前者要好于后者.鸡胚在接种鸡痘种毒后,不但绒毛尿囊膜产毒,而且其尿囊液和出现充血的胎儿中也会有很高浓度的鸡痘病毒.而制造鸡新城疫疫苗主要是收取尿囊液.     

鸡传染性喉气管炎弱毒活疫苗生产工艺的优化及改进试验

《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定,在生产鸡传染性喉气管炎弱毒活疫苗时,采用鸡胚尿囊腔接种和人工气室绒毛尿囊膜接种工艺生产成品。由于人工气室绒毛尿囊膜接种早死胚多,而且工艺比较繁琐,所以我国大多数生产企业在生产中多采用尿囊腔接种方法,但尿囊腔接种后病毒繁殖时间要比人工气室绒毛尿囊膜接种后延长1~2 d,增加了孵化成本,而且绒毛尿囊膜病变(增厚、水肿等)也不如人工气室绒毛尿囊膜接种后产生的病变严重(膜重)。为此,借鉴了鸡痘鹌鹑化弱毒活疫苗的新生产工艺———鸡胚绒毛尿囊膜渗透法[1],并将此方法用于鸡传染性喉气管炎…     

鸡马立克氏病的诊断及防制

鸡马立克氏病是鸡常见的病毒性传染病,又称鸡麻痹症,对养鸡业危害很大,可造成重大损失. 1 病原 该病毒能在鸡胚绒毛尿囊膜上产生典型的痘斑,卵黄囊接种较好.能在鸡肾细胞、鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞上生长产生痘斑. 完整病毒的抵抗力较强,在粪便和垫料中的病毒,室温下可存活4～6个月.细胞结合病毒在4℃可存活2星期,在37℃存活18小时,在50℃存活30分钟,60℃只能存活1分钟.     

鸡传染性法氏囊病毒增殖和纯化方法的研究

本试验通过IBDV标准毒株(IBDVBC6/85F4)和IBDV河北分离株分别接种于SPF鸡胚以及鸡胚成纤维细胞(CEF)。吸取接毒后2～5天内死亡鸡胚的尿囊液和绒毛尿囊膜,及细胞病变达到80%时的细胞培养液。经反复冻融,利用氯仿沉淀病毒,聚乙二醇6000浓缩病毒,蔗糖梯密度低温超速离心和葡聚糖G-200凝胶柱过滤等方法纯化病毒。经分光光度计检测,病毒的蛋白含量为1.377毫克/毫升,琼脂扩散试验证实被检抗原为IBDV。     

不同细胞培养基细胞培养动力学比较试验

应用宜兴赛尔生物化工厂产１９９、Ｆ－１０、１６４０和ＤＭＥＭ细胞培养基与美国Ｓｉｇｍａ公司产１９９、Ｆ－１０、１６４０和ＤＭＥＭ细胞培养基分别配制细胞培养液，培养ＳＰ２／０和Ｖｅｒｏ细胞系及原代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），做细胞培养动力学比较试验。比较这两种来源的细胞培养基对细胞生长的形态、分裂速度及鸡马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ．ＭＤＶ）疫苗毒株ＨＶＴ－ＦＣ１２６和ＲｉｓｐｅｎｓＣＶＩ９８８在ＣＥＦ单层上增殖量的差异。研究结果表明，四种国产细胞培养基与对应的四种进口培养基对细胞生长及病毒增殖的影响无显著差异     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒（FWPV）株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞（CEF）和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为（258~344） nm×（153~238） nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV（登录号：NC_002188.1）核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

整合禽网状内皮组织增殖病病毒基因的鸡痘病毒野毒株致病性研究

以分离保存的整合禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）基因的鸡痘病毒（FPV）野毒株接种CEF细胞,间接免疫荧光试验检测REV,结果未检测到游离REV病毒粒子;以该毒株人工感染7日龄SPF雏鸡,同时设阴性对照,常规免疫新城瘦弱毒苗（ND）。接毒后每周采血动态检测NDV抗体、REV抗体、REV病毒血症;同时对试验鸡免疫器官指数、组织学变化动态观察,并对免疫器官的细胞凋亡动态检测。结果表明,整合REV基因的FPV感染后2周可引起鸡REV病毒血症,并产生REV抗体;导致中枢免疫器官发育分化不良,尤其对胸腺的影响最为明显,攻毒2周后,试验组与对照组相比,胸腺指数明显下降（P〈o．05）;免疫器官主要表现实质细胞数量少,正常结构发育不良,间质结缔组织增生而发生纤维化;细胞凋亡检测证实免疫器官的淋巴细胞和巨噬细胞均有明显的凋亡现象,细胞凋亡是引起免疫器官萎缩的主要原因。对新城疫疫苗免疫反应呈显著的抑制作用,攻毒3周后,试验组血清新城疫病毒抗体滴度显著低于对照组（P〈0．05）,其抗体滴度峰值低,维持时间短,下降速度快。本试验证实FPV整合REV前病毒基因组会明显改变FPV的致病性,表现某些REV的致病特征,使感染鸡REV抗体转为阳性并出现病毒血症,进一步证实REV可以通过基因组整合于FPV而进行传播的推测。     

从表现腺胃炎的病鸡中分离到1株网状内皮增生症病毒

从表现传染性腺胃炎的病鸡中分离到 １ 株病毒。该病毒呈球形,真径 ８０～１００ ｎｍ ,有囊膜。将病料接种于鸡胚成纤维细胞,分别用单克隆抗体免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验,证明该病毒为网状内皮组织增生症病毒。用细胞培养物接种于 １ 日龄健康鸡,复制出与临床完全相同的症状。     

表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究

为了评价转基因对鸡痘病毒(FPV)生物学特性的影响,通过电镜观察表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明:在FPV中插入NDV HN基因后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程;rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无...     

猫泛白细胞减少症病毒的分离与鉴定

从临床表现有体温升高、呕吐、血样腹泻、脱水等症状的疑似猫泛白细胞减少症感染的病例采取粪样28份。从粪便样品中成功分离获得了7株猫泛白细胞减少症病毒（FPV）：JX-1、JX-2、JX-3、JX-4、JX-5、JX-6和JX-7;应用F81细胞增毒,盲传至3代时在F81细胞上产生细胞病变(脱落、变形、游离等);核酸型鉴定证明,FPV毒株的代谢可被5-IUDR所抑制,其核酸属于DNA型;所分离的病毒培养物能凝集猪的红细胞（凝集效价达2⁶～2⁸）,并能被标准FPV阳性血清所抑制;电镜观察病毒粒子外观呈圆形或六边形,直径20～30 nm;该病毒耐酸、耐热、耐乙醚;动物致病性试验,经口感染分离细胞培养毒1 ml,试验组幼猫第7 d发病,采集病猫粪样做HA试验为阳性反应,做HI试验,其凝集猪红细胞的能力被抑制。     

Characterization of an avianpox virus isolated from an Andean condor (Vultur gryphus)

A novel pox virus, condorpox virus (CPV) isolated from the spleen of an Andean condor (Vultur gryphus) by inoculation of chorioallantoic membranes (CAM) of specific pathogen free (SPF) chicken embryos was compared biologically, antigenically and genetically with fowlpox virus (FPV), the type species of the genus Avipoxvirus. Susceptible chickens inoculated with CPV developed only mild localized lesions but were not protected against subsequent challenge with FPV. Based on Western blotting, in addition to the presence of cross-reacting antigens, distinct differences in antigenic profiles of CPV and FPV were observed. Sequence analysis of a 4.5 kb HindIII fragment of CPV genomic DNA revealed the presence of eight co-linear genes corresponding to FPV open reading frame (ORF)193-198, 201 and 203. Interestingly, reticuloendotheliosis virus (REV) sequences present in the genome of all FPV were absent in CPV. Although, the results of a phylogenic analysis suggested that CPV is a member of the genus Avipoxvirus, its unique antigenic, biologic and genetic characteristics distinguish it from FPV to be considered as a new member of this genus.     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

Molecular characterization of a poxvirus isolated from an American flamingo (Phoeniconais ruber rubber)

An avian poxvirus from the beak scab of an American flamingo (Phoeniconais ruber rubber) was isolated by inoculation on the chorioallantoic membrane (CAM) of specific-pathogen-free (SPF) chicken embryos. The virus produced multifocal areas of epithelial hyperplasia along with foci of inflammation in the CAM, and rare cells contained small eosinophilic intracytoplasmic bodies. Chickens inoculated with the isolated virus in the feather follicle of the leg did not develop significant lesions. Nucleotide sequence comparison of a PCR-amplified 4.5 kb HindIII fragment of the genome of flamingo poxvirus (FlPV) revealed very high homology (99.7%) with condor poxvirus (CPV), followed by approximately 92% similarity with canary poxvirus (CNPV) and Hawaiian goose poxvirus (HGPV), but less similarity (approximately 69%) to fowl poxvirus (FPV), the type species of the genus Avipoxvirus of family Poxviridae. As in the cases with CPV, CNPV, and HGPV, genetic analysis of FlPV revealed an absence of three corresponding FPV open reading frames (ORF199, 200, and 202) and an absence of any reticuloendotheliosis virus (REV) sequences in this region. There are only nine nucleotide substitutions observed between FlPV and CPV in the 4.5 kb fragment; those were clustered in the ORF201 region, which in FPV genome is a site for integration of REV sequences. Phylogenetic analysis of the predicted amino acid sequences of the ORF201-coded hypothetical protein demonstrated FlPV to be more closely related to CPV, as well as to CNPV and HGPV, than to FPV.