表达猪圆环2型的多拷贝P28-Cap重组猪痘病毒的构建及表达量分析

为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型（PCV2）-Cap蛋白，插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系。本试验以猪痘病毒为载体，通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒，并纯化到了8株含不同拷贝数（1~8拷贝） P28-ORF2的重组猪痘病毒，基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断。纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41~384.96 μm，大小无明显差异。重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致。Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低；随着P28-ORF2拷贝数的增加，PCV2-Cap表达量也随之增加；至插入4拷贝P28-ORF2时，PCV2-Cap表达量达到峰值；随后减少。8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异，表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响。重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响。本研究结果表明，猪痘病毒为载体表达外源蛋白时，单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量，插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数。     

一例猪链球菌病的诊断及其病原分离鉴定

对某猪场送检的一份出现神经症状的保育仔猪病料进行了细菌分离,并对该分离菌株进行了染色镜检、生化鉴定、PCR检测和药敏试验。革兰氏染色结果表明从病料中分离到1株革兰氏阳性链状球菌,其生化鉴定结果与猪链球菌生化特性一致。分离菌株16srRNA基因测序结果表明其与2型猪链球菌亲缘关系最近,同源性达100%,确定该分离菌株为2型猪链球菌。药敏试验结果表明该分离菌株对青霉素、恩诺沙星、氨苄西林、氟苯尼考、头孢噻肟、阿莫西林、氧氟沙星、诺氟沙星等高度敏感;对复方新诺明、多西环素、土霉素、头孢曲松、丁安卡那等中度敏感,对磺胺异恶唑耐药。     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒（FWPV）株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞（CEF）和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为（258~344） nm×（153~238） nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV（登录号：NC_002188.1）核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备

[目的] 构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猪痘病毒（recombinant Swinepox virus,rSWPV）,制备抗GFP单克隆抗体。[方法] 首先合成3'-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV（SWPV-JX20G株）同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。[结果] PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1：256 000。采用杂交瘤技术制备了9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位。[结论] 本研究成功制备了EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料。     

猪增生性肠炎的诊断及其在猪群中感染的调查

针对江西某猪场肥猪出现血便症状,取病变肠组织提取DNA,采用猪胞内劳森菌荧光定量PCR试剂盒检测,并对PCR扩增产物进行序列测定和分析,结果表明,其与胞内劳森菌参考序列(AM180252.1和CP004029.1)同源性为100％.同时采集7个猪场的正常猪群粪便通过猪胞内劳森菌的荧光定量PCR检测方法进行检测,结果显示,猪增生性肠炎在各猪场的感染率为16.7％～40％,平均感染率为30.06％.