猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用

为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ),将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ.将线性化的pPIC 9K-mPoIFNγ以化学方法(LiCl)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型),转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418(4 g/L)筛选到多拷贝菌株.SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65%;细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106 U/mg.     

H1N1猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因,亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子,经SDS-PAGE和Western-blot检测,H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达,产物约60.4KD,并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

猪流行性腹泻病毒纳米抗体融合蛋白真核表达及鉴定

为防控猪流行性腹泻病毒(PEDV)病的流行,构建了靶向PEDV NB3-NB6-Fc纳米抗体融合蛋白的真核表达载体,并探究能否在毕赤酵母中分泌表达。通过实验室保存的pUC57-NB3-NB6-Fc质粒,成功构建分泌表达载体pPIC9K-NB3-NB6-Fc,经SacⅠ酶将其线性化并电转化入毕赤酵母GS115菌株。经过MD、梯度G418-YPD平板和PCR方法筛选多拷贝阳性重组转化子。经鉴定为阳性重组菌株用8 mL/L甲醇在29℃条件下诱导72 h,用SDS-PAGE和Western blot方法检测上清液中重组蛋白的表达情况。结果显示,成功诱导出大小为53.2 ku的分泌型重组蛋白,经Swiss-model在线预测该蛋白具有相对紧密的空间结构。成功获得pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115分泌表达菌株,可为PED的预防和治疗提供材料。     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建与发酵研究

本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

依据GenBank猪肠激酶催化亚基(EKL)基因的编码序列设计引物,通过RT-PCR方法从猪小肠黏膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和Not Ⅰ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建EKL基因分泌型酵母重组质粒载体pPIC9K/EKL.重组质粒载体经Sal Ⅰ线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中.然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选获得高拷贝猪EKL基因的重组酵母.经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中.重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到相对分子质量为35 000的重组蛋白.经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明制备的重组猪EKL具有生物活性.     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

为了获得在体外表达的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,研究其免疫原性,试验根据GenBank公布的国内PCV2-Cap蛋白基因序列特点,结合毕赤酵母密码子偏好对Cap基因进行优化,合成目的基因后,构建分泌型表达载体pPIC9K-Cap,转化毕赤酵母GS115后,经诱导表达获得重组Cap蛋白。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后检测抗体水平。结果表明:含有PCV2-Cap基因的质粒成功转化到酵母菌基因组中,重组酵母菌株在30℃,经1%甲醇诱导表达96 h后,培养液中能够检测到33 ku的重组蛋白,重组蛋白表达量为155μg/mL,占培养上清液总蛋白的9.362%,Western-blot试验结果显示重组蛋白具有良好的抗原活性。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后,能够刺激豚鼠产生特异性抗体且与接种0.3头份/只剂量的市售PCV2灭活疫苗产生的抗体水平无显著差异(P0.05)。说明成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2-Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原活性。     

重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定

根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因，将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPlC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86，测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌Gs115，经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达，SDSPAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68ku重组Bm86蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32％以上，诱导96h目的蛋白的表达量为0．36mg／mL。