鸵鸟H5N1亚型高致病性禽流感病毒的分离与鉴定

从某鸵鸟场病死鸵鸟的脑和脾中分离到1株禽流感病毒.其血凝价为6log2.血清学试验结果表明其血清型为H5N1.致病性试验结果表明该分离株对鸡表现为高致病性.电镜观察结果显示,该病毒为典型的禽流感病毒粒子.利用RT-PCR扩增出了与预期片段相同的特异性型扩增产物,大小约为900个碱基.该病毒株暂命名为:A/ostrich/HeNan/14/2002(H5N1)(简称HN/2002).     

高致病性禽流感防治知识问答

1什么是禽流感?什么是高致病性禽流感?禽流感是禽流行性感冒的简称,是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)传染病。禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道症状、消化道症状,死亡率较低;或表现为较严重的全身性、出血性、败血性症状,死亡率较高。这种症状上的不同,主要是由禽流感病毒的毒力所决定的。根据禽流感病毒致病性和毒力的不同,可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。禽流感病毒有不同的亚型,由H5和H7亚型毒株(以H5N1和H7N7为代表)所引起的疾病称为高致病性禽流感(HPAI),最近国内外由H5N1亚…     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

湖南省洞庭湖区5株H6N6亚型禽流感毒株HA、NA基因的遗传进化分析

为了从分子生物学角度了解H6N6亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律,为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据,对2012年在洞庭湖区分离的H6N6亚型禽流感毒株的HA、NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的5株H6N6亚型禽流感毒株HA裂解位点为PQIETR↓GLF,均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒;5株病毒的HA和NA潜在的糖基化位点有一些差别,这些差别是否会引起其毒力和致病力上的差异还有待研究;从基因遗传进化关系来看,这些毒株与我国汕头、广西分离的毒株同源性较高。     

鸵鸟HSN1亚型高致病性禽流感病毒的分离与鉴定

从某鸵鸟场病死鸵鸟的脑和脾中分离到1株禽流感病毒。其血凝价为6l0g2。血清学试验结果表明其血清型为H5N1。致病性试验结果表明该分离株对鸡表现为高致病性。电镜观察结果显示．该病毒为典型的禽流感病毒粒子。利用RT—PCR扩增出了与预期片段相同的特异性型扩增产物．大小约为900个碱基。该病毒株暂命名为：A／ostrich／HeNan／14／2002(H5N1)(简称HN／2002)。     

重组高繁殖力疫苗株H5N2(H5/PR8)病毒的制备和鉴定

作为禽流感疫苗株,不但要求其具有良好的免疫原性,而且要求在生产中具有良好的生长特性,现用的A/Turkey/England/N28/73(H5N2)疫苗株,血凝价28,生长滴度较差.本研究利用自然重组法,预制备一株高繁殖力的预备疫苗株,使它的表面基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)来源于A/Turkey/England/N28/73(H5N2)毒株,并使其保持原有的良好的免疫原性,内部基因来源于流感病毒PR8,A/Puerto Rico/8/34(H1N1)毒株,并使其重组病毒赋有了流感病毒PR8高繁殖力的特性.实验结果表明,已获得一株高繁殖力的重组流感病毒H5/PR8,血凝价达到211,生长繁殖特性明显增强.抗原性分析显示,H5/PR8重组病毒与亲本毒株H5N2抗原性无明显差异;致病性分析发现,H5/PR8重组病毒的致病能力较亲本毒株H5N2有明显下降.这为疫苗株的改良奠定了坚实的基础,对禽流感灭活疫苗的生产具有重大意义.     

OIE陆地动物诊断试验和疫苗手册(高致病性禽流感)

高致病性禽流感(HPAI)亦称鸡瘟,是由正粘病毒科的成员特定的A型流感病毒引起的.流感有三型A、B、C;只有A型流感病毒被认为能感染禽类.因为禽感染禽流感后的临床症状有多种表现形式,可因宿主、毒株、免疫状态、继发感染及环境条件的不同而有很大的变化,对该病的诊断是通过病毒分离和鉴定作出的.病原鉴定采集活禽气管和泄殖腔的拭子(或粪便)或者死禽的粪便和器官,加抗生素制成悬液,接种到9～11日龄鸡胚尿囊腔内.置35～37℃孵育4～7天,检测死胚和所有到孵化末期鸡胚尿囊液的血凝活性.尿囊液里的A型流感病毒可经浓缩和A型流感病毒共有的核衣壳或基质抗原的抗血清作免疫扩散试验确诊.目前,在特定条件下,病毒分离法已经被反转录多聚酶链式反应取代.进行病毒亚型鉴定,实验室必须具备用于免疫扩散试验的抗每一种亚型A型流感病毒的15种血凝素(H1～H15)抗原和9种神经氨酸酶(N1～N9)抗原的单因子抗血清.除此之外,新分离的病毒也可以用一系列能覆盖所有亚型的各种毒株的多克隆抗血清进行血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验来鉴定.HPAI和"鸡瘟"是特指A型流感病毒强毒株的感染,因此,有必要评估分离毒株对家禽的毒力.虽然至今所有分离到的强毒株不是H5亚型就是H7亚型,但大多数H5或H7分离毒株是低毒力的.近年来,随着对禽流感致病性的分子机理的了解,出现了一些检测禽流感毒力的方法,但是,最基本的方法还是把病毒接种于至少8只4～8周龄的易感鸡,10天内如果死亡率高于75%,则认为该病毒株为高致病性.疑似致病毒株的分离鉴定应该在病毒安全实验室进行.血清学试验由于所有A型流感病毒的核衣壳和基质蛋白的抗原性都相似,可用琼脂凝胶免疫扩散试验来检测针对这些抗原的抗体.该试验所用的浓缩抗原含有这两种抗原中的任何一种或全部,但不是所有禽类感染后都能出现沉淀抗体.血凝抑制试验可作为禽流感的常规血清学诊断法,但由于血凝素具有亚型特异性,可能会出现漏检现象.酶联免疫吸附试验(ELISA)已经用于检测抗A型流感病毒特异性抗原的抗体.对疫苗和诊断用生物制品的要求大多数国家,政府机构都禁止或不鼓励使用疫苗来控制或预防HPAI,因为这可能会干扰扑灭政策的实施.在20世纪90年代,墨西哥和巴基斯坦为了控制广泛暴发的HPAI,采用油乳剂灭活苗进行该病的预防,在墨西哥表达同源HA基因的重组禽痘病毒苗也进行了田间试验.1999～2001意大利暴发禽流感时,采用的灭活苗的疫苗株和野毒株有相同的血凝素但神经氨酸苷酶不同,这样就能够区别疫苗免疫禽和野毒感染禽.如果应用HPAI生产疫苗或做攻毒试验,需要具备OIE规定的第4类病原防护设施.     

4株H9N2亚型禽流感病毒分离株对SPF鸡致病性研究

对2013~2015年,从各省养鸡场分离的4株H9N2亚型禽流感病毒进行致病性试验,结果显示,4株H9N2亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡后,所有鸡均发生感染并排毒,感染鸡泄殖腔排毒量明显高于口腔,致病性强的毒株比致病性弱的毒株排毒时间要长,在接种后的3~5 d个别鸡表现出精神沉郁,缩头闭眼的情况,并且整体出现食欲下降,但并没有鸡死亡;4株H9N2亚型禽流感病毒感染SPF鸡后,在鸡脏器中的分布各不相同,致病性强的毒株比致病性弱的毒株更具有较广的组织嗜性,在鸡体内各个组织器官复制能力更强。结果表明,4株H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡均具有一定的致病性。     

H5N1 亚型禽流感病毒在 MDCK 细胞中增殖条件的研究

目的：探索H5N1亚型禽流感病毒在MDCK中增殖规律,确定最佳增殖条件。方法将H5N1亚型禽流感病毒接种到6孔板培养的MDCK细胞进行增殖试验,检测不同病毒感染量、不同浓度TPCK-胰酶,接毒后不同时间病毒的HA滴度。根据确定的最佳增殖条件将病毒接种到微载体培养的MDCK细胞中进行大规模增殖。结果：最佳病毒增殖条件接毒量MOI为5＆#215;10-4、TPCK-胰酶浓度为4μg/mL,在5 L生物反应器中重复验证,获得稳定的试验结果,病毒血凝价最高为8 log2。结论：本研究为禽流感疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

禽流感的最新动态

<正>1禽流感有新的威胁吗?禽流感对美国家禽业已造成了较大的损失并有感染猪的可能性,尽管迄今还没有发生。但在美国出现的一种H3N8亚型的禽流感病毒有感染猪的可能。令人担心的是,标准血凝试验是检测畜禽流感的重要工具,但是对感染H3N8病毒猪的检测结果却呈阴性。英国Pirbright研究所和西班牙的CRESA研究所发现,两种不同毒株的H3N8病毒能够在猪中复制并感染,其中一种是从海豹体内分离     

禽流感病毒血清型多样性且具有很高的变异

禽流感病毒是属 A型正粘科病毒,病毒表面有血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA)两种糖蛋白。由于病毒表面血凝素和氨酸酶各不相同,所以又将流感病毒分为 H1N1、 H4N2、 H5N7、 H7N2、 H5N2等等不同血清型,禽流感的致病性差异很大,一般认为血清型为 H7和 H5的病毒株是强致病性的,但现在发现 H7和 H5的毒株也有低致病性。 　　禽流感病毒具有很高的变异性,病毒在宿主细胞中极易发生遗传基因重组 (变异 ),形成新的病毒毒株,这种遗传基因重组往往是受到外来作用后发生的。因此重组后新的病毒毒株更具有致病性和抵抗力。比如,一种禽流…     

H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒.     

2株H9N2亚型禽流感病毒对鹌鹑的致病性

选用分离于湖北省某2个城市活禽市场的2株鸡源H9N2亚型禽流感病毒毒株(A/chicken/Daye/DY0602/2017)和(A/chicken/Jinmen/JM0305/2017),将病毒以10~(7.0) EID_(50)/100μL的剂量滴鼻感染28日龄鹌鹑,均未见明显的临床症状。组织病理学结果显示,2个毒株均可导致鹌鹑心脏、肺脏、气管、喉头较为严重的病理损伤,且毒株DY0602感染组鹌鹑比毒株JM0305感染组鹌鹑心脏、肺脏组织表现出更严重的病理损伤;免疫组化结果显示,毒株DY0602感染组鹌鹑肺组织中病毒表达量更高。这些数据表明,鹌鹑对活禽市场鸡源H9N2亚型禽流感病毒易感,并且不同地区的H9N2亚型禽流感病毒可以导致鹌鹑表现出明显的致病性差异,建议加强对活禽市场H9N2亚型禽流感病毒的检测,进而及时为鹌鹑禽流感的防控制定有效措施。     

重组禽流感二价灭活疫苗（H5+H7）有效抑制H7N9亚型禽流感病毒在鸡肺脏中的复制

从2013年至2017年上半年,H7N9亚型流感病毒已经引发五波疫情,且出现高致病性变异毒株。禽流感为高度接触性传染病,通过气溶胶进行传播的风险性较高。为探究H7N9亚型禽流感病毒能否在经H5+H7二价灭活苗免疫鸡的肺脏中有效进行复制,本研究选取H5+H7二价灭活苗对2周龄SPF鸡以0.3m L/只的剂量进行免疫,并在免疫14 d测定抗体滴度后以H7N9亚型禽流感病毒对免疫组与空白组SPF鸡点眼滴鼻方式攻毒,3d后剖杀采集肺脏进行病毒分离鉴定,结果显示免疫鸡肺脏中不含H7N9亚型禽流感病毒,而空白组SPF鸡能分离鉴定出H7N9亚型禽流感病毒。重组禽流感二价灭活苗(H5+H7)能有效抑制H7N9亚型禽流感病毒在鸡肺脏中的复制。     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

荷兰、英国等国家出现哺乳动物体内检测到H5N1禽流感病毒株

正在荷兰的两只狐狸中检测到H5N1禽流感病毒株,在英国和瑞典的海豹中检测到H5N8病毒株。病毒向哺乳动物的传播,表明病毒正在发生变异以增强传播性和适应性。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。     

重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗免疫效果的评价

为了评价重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗的免疫效果,在2016年7月至2017年8月期间,对免疫重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-7株+Re-8株)的家禽采集了1 999份血清样品,采用血凝与血凝抑制方法进行检测,结果为H5亚型禽流感病毒Re-6株免疫合格率为86.84%,H5亚型禽流感病毒Re-7株免疫合格率71.44%,H5亚型禽流感病毒Re-8株免疫合格率为67.78%。结果表明,免疫重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗后,不同毒株的抗体、不同种类的家禽、不同免疫次数的抗体水平均有差异。     

从貉中分离到的高致病性H5N1亚型禽流感病毒的分子特性

高致病性H5N1亚型禽流感病毒可以感染各种动物,并对动物和人类健康造成持续性威胁。虽然在鸡体内发现H5N1亚型禽流感病毒的许多种基因型,但是只有为数不多的几种基因型可以感染哺乳动物。鉴定动物种群中病毒株基因型,这对了解不同病毒株在各种宿主中的分布十分重要。当特定基因型的高致病性毒株出现在之前未报道的携带有该基因型的未知宿主中,有利于对其进行监控和检测。从2只死于呼吸道疾病的貉的肺样品中分离得到2株H5N1亚型禽流感病毒。病原性检测显示所分离到的病毒对鸡是高致病性的。为了分析这些病毒基因型的特性,将其基因组序列进行测定和分析。这些分离到的病毒的遗传物质是相同的,并且它们可能来自与同一个病毒祖先。系统进化树分析结果表明,分离到的病毒在遗传上与2003年第一次在中国分离得到的H5N1亚型禽流感病毒的V基因型十分相近,与近年来占主导位置的病毒基因型（如Z基因型）不同。分离到的病毒在其HA剪切位点还包含了一个多基的氨基酸基序,在PB2蛋白的627位存在一个谷氨酸残基,这与之前经证实的禽病毒相似。本试验首次发现H5N1亚型禽流感病毒V基因型存在于与哺乳动物相关的宿主中。研究结果有力的揭示了H5N1病毒V基因型能跨越种间障碍而感染哺乳动物。这些发现进一步显示出H5N1亚型禽流感病毒对哺乳动物和人类造成的危害。     

重组禽流感病毒(H5N2)的拯救及其生物学特性分析

为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。