原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位PCR介绍较多，而对于原位反转录PCR的介绍很少，但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是RNA(病毒的或基因组的RNA)的实际情况，就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤，如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述，旨在通过探讨上述问题，对该技术的实际应用有所指导。     

原位杂交组织化学技术中信号扩增的研究进展

原位杂交组织化学(ISHH)技术是利用两条互补单链之间通过核酸分子碱基的氢键配对反应形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学方法,在核酸原有的位置上把它显示出来。目前它已是一种比较成熟的技术,因其能对核酸进行原位检测而得到广泛的应用。ISHH的种类很多,其方法的改进主要在于检测信号提高上目前用于信号扩增的方法主要有原位PCR侧链系统、酪胺信号放大、催化报告分子沉淀、尾探针原位杂交和原位引物延伸标记这些方法的建立,不同程度的提高了信噪比使ISSH的灵敏性增加并得到广泛的应用。     

原位PCR检测雏鹅体内鹅细小病毒方法的建立及其应用

通过建立能对石蜡切片中鹅细小病毒(GPV)核酸进行定位的原位PCR方法,为GPV在鹅体内的定位、致病机理研究等提供有效的试验手段.根据GPV的VP3基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以GPV感染鹅肝脏和空肠组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和碱性磷酸酶标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中GPV的间接原位PCR方法并应用于自然感染GPV高免血清紧急免疫后鹅肝脏和空肠组织临床病料检测.结果显示间接原位PCR对人工感染GPV死亡鹅肝脏和空肠的石蜡标本检测结果为阳性,而鹅病毒性肝炎、鹅多杀性巴氏杆菌病、鹅沙门菌病和鹅大肠杆菌病死亡鹅肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对自然感染GPV高免血清紧急免疫后第6天的鹅肝脏和空肠组织检测20个样本中,空肠组织有8个呈阳性,肝脏组织有4个阳性结果均为阳性,阳性细胞有空肠上皮细胞、肝窦上皮细胞等.     

等温扩增技术概述及其在动物病原检测中的应用

等温扩增技术是一种可以在恒定温度下进行体外核酸扩增的技术,近几年其研究热度很高。本文从技术原理、优缺点及在动物病原检测应用等方面,对环介导等温扩增技术（LAMP）、重组酶等温扩增技术、依赖核酸序列扩增技术（NASBA）、交叉引物等温扩增技术（CPA）和赖解旋酶等温扩增技术（HDA）等5种常见等温扩增技术进行了综述。LAMP技术操作简单,不依赖特殊设备,但引物设计较为复杂,研发多重LAMP检测方法有很大困难。重组酶等温扩增技术不受场地条件约束,扩增时间短,但容易造成气溶胶污染,因此一般用于实验研究。NASBA技术扩增效率高,不易产生污染,但成本偏高,操作相对复杂,在目前疫病检测研究中的应用逐渐减少。CPA技术操作相对简单,灵敏度高,特异性好,但结果判断受主观因素影响易造成假阳性或假阴性。HDA技术引物设计相对简单,但反应体系较为复杂,因此不适合扩增长序列。不同的等温扩增技术需要根据实际需求和场景条件来选择。等温扩增技术作为一种新兴技术具备许多优点,但仍需要不断改进,未来与微流体芯片、纳米金、CRISPR等技术联合应用,将会实现更加快捷、准确、简便的检测,从而为动物疫病检测提供更好的服务。     

原位PCR技术在兽医分子生物技术中的应用

本文阐述了原位PCR技术的原理、操作步骤及注意事项，原位PCR中非特异性问题及主要技术难点，原位PCR结果对照实验的目的和设计方法，不同原位检测技术的应用比较及其在兽医分子生物技术的应用和前景。对临床兽医分子水平的研究和诊断具有一定的指导作用，是兽医分子生物技术的重要研究内容。     

动物疫病PCR检测实验室的污染与对策

PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)技术是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家Mullis于1985年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,又称为基因的体外扩增法。这种技术操作简单,容易掌握,有极高的灵敏度,结果可靠。近几年,随着PCR相关技术的发展,复合PCR、定量PCR、荧光PCR等PCR技术在动物疫病的快速检测方面得到了广泛应用,为动物疫病的诊断及检验检疫提供了良好的依据。但该方法较强的扩增能力也带来了令人头痛的问题?易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。1引起PCR污染的因素1.1 PCR试剂的…     

原位PCR技术及其在病理学中的应用

原位PCR技术是在原位杂交和PCR技术的基础上发展起来的一种分子生物学技术,可在组织切片或整个细胞上检测单复制或低复制的核酸样品,兼具两者的优势,具有特异性强、敏感度高、定位准确的特点.在病理学领域,原位PCR技术不仅可以用于检测细胞或组织中微生物病原的核酸,还可以分析肿瘤、遗传性疾病等内源基因的变化,以及跟踪疾病与治疗过程带来的基因组改变,在分子水平上阐明疾病发生发展与致病因子之间的相互作用,在病理学研究与诊断中得到越来越广泛的使用.     

等温扩增技术的原理及其在病原检测中的应用

等温扩增技术(IAT)作为一种新型的体外核酸扩增技术,与PCR相比,该技术具有特异性强、敏感性高、简单便捷和成本低等优点。目前,等温扩增技术在病原检测方面得以应用,论文对环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶的等温扩增(HDA)、依赖核酸序列的等温扩增(NASBA)、链置换等温扩增(SDA)、交叉引物扩增(CPA)5种扩增技术的原理、特点及应用分别予以介绍,为该技术在病原检测的实际应用提供参考。     

H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测技术

根据GenBank中H5N1亚型流感病毒HA基因保守区的序列,设计1组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP反应体系,优化LAMP反应条件,最佳等温扩增反应条件为65℃保温60min。扩增后产物加入核酸染色剂SYBRⅠ和4 mmol/L Mg2+,结果可视。扩增产物可用特异性内切酶KpnⅠ进行酶切鉴定。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法一致。RT-LAMP技术整个检测过程只需1~2 h,不需要PCR仪和成像系统,仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验,验证了建立的RT-LAMP技术可以作为一种操作简单,灵敏性、特异性高的检测H5亚型禽流感病毒的方法。     

PCR技术在原虫病诊断中的应用

聚合酶链反应(Polymerasrchainreaction,PCR)作为一种快速体外基因扩增技术,因其操作简便、敏感性好、结果可靠等优点,近年来在生物医学的各个领域得到广泛应用。本文就PCR技术在原虫病诊断中的应用,做一综述。     

A novel repeated sequence located on the bovine Y chromosome: its application to rapid and precise embryo sexing by PCR

A novel repeated sequence specific to male cattle was identified and named S4. S4 is a highly repetitive sequence and is a 1.5 kb repeating unit that contains various internal repeated sequences. FISH analysis showed that S4 is localized on the whole long arm and the proximal region of the short arm of the Y chromosome. We found that a PCR primer set for S4 amplified a male-specific 178 bp product in addition to a 145 bp product common to both male and female cells. Although the origin of the 145 bp product is unknown, it acts as a positive internal control in practical embryo sexing. Due to the high copy number of S4, PCR required only 0.5 pg purified DNA for accurate amplification. This made it possible to reduce the amount of biopsy sample required for embryo sexing and thus result in less damage to embryos manipulated. These studies indicate that embryo sexing based on the S4 sequence is accurate and sensitive.     

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

Identification of an alkaline ceramidase gene from Dermatophilus congolensis

A random amplified polymorphic DNA (RAPD) procedure was used to identify a specific 0.6 kb DNA fragment unique to Dermatophilus congolensis. This 0.6 kb fragment was evaluated as a specific DNA probe and used to design oligonucleotide primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification. The nucleotide sequences adjacent to this DNA fragment were determined by inverse PCR allowing the identification of a 4.1 kb sequence. Analysis of this revealed a complete open reading frame (ORF) with a high similarity to an alkaline ceramidase from Pseudomonas aeruginosa. The molecular weight of the enzyme derived from the predicted amino acid sequence is 74,662 Da, its pI is 9.81. The predicted N-terminal sequence of the enzyme contains a signal sequence indicating that the enzyme is exported by the bacterium. Since ceramides have important protective and cell regulatory roles in the epidermis we suggest that this ceramidase may have a role in the pathogenesis of dermatophilosis. It is the first completely sequenced gene described for D. congolensis.     

高原牦牛乳铁蛋白素基因克隆及序列分析

利用PCR技术从高原牦牛基因组DNA中获得了乳铁蛋白素(lactoferricin,Lfcin)基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM T easy载体,送至生物公司测序;将高原牦牛与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白序列进行分析。结果表明：克隆获得了含高原环湖牦牛LF(lactoferrin)第2外显子的DNA序列,共778 bp,其中Lfcin基因编码区长75 bp,编码25个氨基酸; 序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛这一序列存在9个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性。     

应用MGB荧光探针技术确定猪KIT基因拷贝重复数

旨在建立一种简便、快速检测猪KIT基因拷贝重复数(CNVs)的方法并应用于未知样品的检测。在KIT外显子2中设计TaqMan-MGB探针和引物,建立荧光实时定量PCR检测KIT基因CNVs的方法。结果表明,TaqMan-MGB探针扩增KIT基因目的片段,不同DNA梯度浓度Ct值差异极显著(P<0.001),变异系数低(0.12%～0.26%);KIT与内标基因ESR的扩增效率相差只有2.4%;采用聚类分析推测了待测的50枚样品KIT的CNVs分别归属于2、3、4、5、6个拷贝。本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测KIT基因CNVs的方法,具有简便、快速、特异性和稳定性好的特点,适合于普通实验室应用。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

1株禽传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其实时荧光定量PCR检测方法的建立

自禽传染性支气管炎病毒流行较严重地区的患鸡组织病料中分离得到1株疑似毒株,利用鸡胚培养、气管环及动物回归试验、电镜观察、RT-PCR等多种方法及对其S1基因序列进行比较分析,确定该分离毒株为禽传染性支气管炎病毒QX型。同时针对该新分离的传染性支气管炎病毒建立了实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:针对该分离毒株的S1基因区设计1对引物和TaqMan探针,制备质粒标准品,建立标准曲线,其线性关系为y=-3.385 7x+42.235,R^2=0.999,扩增效率为97.5%,该法能区分常见禽类流行病毒,检测灵敏度可达42.1拷贝数/μL,比普通PCR检测限度高,重复性良好,因而该实时荧光定量PCR检测方法可靠。本试验同时进行了拷贝数与半数鸡胚感染量(EID50)对应关系研究,证明了在控制病毒代次、冻融次数等条件下,建立线性关系为y=0.249 2x+1.341×10^6(以拷贝数为x轴,EID50为y轴),R^2=0.956 4,可实现拷贝数替代EID50。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。