广西地方禽类品种ALV和REV感染情况的调查及ALV分离株gp85基因序列分析

为了解广西钦州地区主要地方品种商品禽类中禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)的感染情况,本试验随机采集了广西钦州地区代表饲养场的麻鸭、狮头鹅、铁脚麻鸡、火鸡、鸽子共5个品种的蛋清、肛拭子及血清样品共953份,使用ELISA商品试剂盒进行检测;然后对部分ALV p27阳性的个体采集其血清样品接种DF-1细胞进行病毒分离并测定其gp85基因的序列。结果发现,除铁脚麻鸡外其他4个非鸡禽类品种的ALV检测均为阴性;除鸽子和狮头鹅外,麻鸭、铁脚麻鸡、火鸡均检测到REV抗体阳性;获得的两株铁脚麻鸡ALV分离株gp85基因之间核苷酸同源性为94.5%,与参考株之间核苷酸同源性为86.9%~94.9%;两株分离株gp85基因之间氨基酸同源性为91.5%,与参考株之间氨基酸同源性为84.0%~91.6%。高变区hr1和hr2区存在较多可变位点,可变区vr2和vr3相对较保守。系统进化树分析结果表明这两个毒株与参考株SCAU11-XG的亲缘关系最近。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒（ALV）贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为：GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%~97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%~99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%~53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

1株E亚群禽白血病病毒的分离鉴定及遗传进化分析

E亚群禽白血病病毒（ALV-E）是指存在于鸡染色体中的内源性逆转录病毒基因组DNA或片段。具有转录活性的ALV-E既会对鸡的生产性能（体重和产蛋率）产生负面影响，又能从抗体水平干扰对外源性ALV的鉴别诊断。为对黑龙江省某鸡场内一禽白血病病毒RT-PCR阳性病料进行病毒分离鉴定及分析其基因组特征和遗传进化情况，通过分子生物学、病毒形态学及全基因组序列测定方法对病毒培养物进行鉴定和分析，结果显示，该分离株可在CEF细胞盲传至第9代，电镜下可观察到近似球形、直径约为80 nm，并具有囊膜和纤突结构的病毒粒子，将其命名为HLJE2020株。序列分析结果显示，其全基因组序列中的gag和pol基因相对保守，LTR和env基因与ALV-E同属一个进化分支，而gp85基因则与ALV-E和ALV-B均具有较高相似性，遗传进化分析显示在ALV-E和ALV-B间出现一个单独的分支，结合RDPv.4和SimPlot软件分析结果，推测该毒株gp85基因可能存在E亚群AF229株与B亚群SDAU09C1株的重组现象。本研究为了解禽白血病病毒基因组遗传演化情况提供数据资料，并为ALV的防控提供参考和依据。     

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。     

不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒-p27抗原结果的影响

为探讨不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒(ALV)-p27抗原结果的影响,试验首先对180日龄地方品种母鸡的泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原进行ELISA检测,选取部分阳性鸡和阴性鸡进行分组试验,采用ELISA对试验鸡血清、蛋清和病毒分离的细胞培养液进行ALV-p27抗原检测,采用RT-PCR方法检测血液ALV特异性基因。结果显示,阳性组中以血清、蛋清和细胞培养液作为ELISA ALV-p27抗原检测材料,其检测阳性率均低于泄殖腔棉拭子,血清检测的阳性个体包含全部蛋清和细胞培养液ELISA检测的阳性个体。ELISA检测数据的相关性分析显示,只有血清和细胞培养液检测数据间存在显著性相关,线性关系方程为Y(细胞上清)=1.8439X(血清)-0.1469,R²=0.937;阳性组中ALV-p27基因检测阳性率低于泄殖腔棉拭子,但高于血清、蛋清和细胞培养液,其包含所有血清ELISA检测的阳性样品;外源性ALV-J gp85基因阳性率仅为29.17%,且阳性样品均属于血清ELISA阳性样品。综上所述,成年鸡以泄殖腔棉拭子作为ELISA ALV-p27抗原检测材料存在假阳性结果,蛋清和细胞培养液作为检测材料存在漏检的可能,血清作为ELISA检测材能够更准确地反映成年鸡群ALV感染状态。     

Effect of Different Test Materials on the Detected Results of Avian Leukosis Virus-p27 Antigen by ELISA

In order to study the effect of different test materials on the detected results of avian leukosis virus (ALV)-p27 antigen by ELISA, the cloacal swabs ALV-p27 antigen were detected by ELISA in 180-day local breeds hen, and the parts of the positive and negative chicken was selected to group test, the serum, egg whites and cell supernatant ALV-p27 antigen were detected by ELISA, the specific genes of ALV were detected by RT-PCR in blood.The results showed that serum, egg white and cell supernatant as ELISA test materials, the positive rate lower of than cloacal swabs, and serum ALV-p27 positive samples include all egg whites and cell supernatant positive samples in positive group.It was a significant correlation between ELISAs with serum and cell supernatant (linear equation:Y=1.8439X-0.1469, the correl was 0.937).In positive group, ALV-p27 gene positive rate lower than cloacal swabs ELISA, but higher than the serum, egg and cell culture medium, and ALV-p27 gene positive samples include serum positive samples by ELISA.ALV-J gp85 gene positive rate of 29.17%, and all positive samples were included in the serum ALV-p27 positive samples.The results suggested that the cloacal swabs as test material may occur false positive results, and egg whites and cell supernatant may occur undetected by ELISA ALV-p27 antigen assay in adult chicken, serum as test material in ELISA could more accurately reflect the state of adult chickens infected with ALV.     

J亚群禽白血病病毒与粪肠球菌混合感染的诊断及相关基因分析

为了解贵阳市某养殖场J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)gp85基因的变异情况及粪肠球菌(Enterococcus faecalis,EF)毒力基因的携带情况,本研究对该养殖场ALV与粪肠球菌混合感染的病例展开了病原学调查分析,采集病料进行病毒核酸检测、gp85基因克隆测序分析、核苷酸序列相似性分析、细菌分离鉴定、毒力基因检测等。结果显示,成功克隆出ALV gp85基因并分离鉴定出1株粪肠球菌,分别命名为GZM52021株和GZEF2021株。ALV核酸检测仅在约422 bp处出现特异性扩增条带,说明存在ALV-J感染;成功克隆ALV gp85基因,且GZM52021株与J亚群参考毒株gp85基因(GenBank登录号为KM655820、KF796654、JN378888和Z46390)的相似性较高,在97.9%~98.2%之间;gp85基因核苷酸序列遗传进化树构建结果与相似性结果一致。GZEF2021株在LB 固体平板上长出圆形凸起、不透明的乳白色菌落,在鲜血琼脂平板上有明显的溶血现象,革兰氏染色镜检为球形或卵圆形阳性链状球菌;16S rRNA测序结果显示,GZEF2021株与粪肠球菌(GenBank登录号为KJ626240、MT611693、KY399248、MH919370、MN379663和KU937389)的相似性均在99%以上;药敏试验结果显示,GZEF2021株对头孢哌酮、青霉素、哌拉西林和羧苄西林4种药物敏感,对复方新诺明、头孢拉定、头孢唑啉3种药物中度敏感,对新霉素、丁胺卡那、多西环素和米诺环素4种药物耐药;毒力基因检测显示,GZEF2021株携带有ace、gelE、asa1、EF3314和efaA 5个毒力基因,说明从鸡中分离出的粪肠球菌可能具有一定的致病性。该病死鸡存在J亚群ALV与粪肠球菌共同感染的情况,本试验结果可为了解J亚群ALV和粪肠球菌在贵州的流行趋势及其混合感染的诊治提供一定的参考资料。     

Phylogenetic analysis of the sigma 2 protein gene of turkey reoviruses

The open reading frame of the S3 segment encoding the sigma2 protein of four turkey reovirus field isolates was analyzed for sequence heterogeneity. The turkey reoviruses we present here have a 97% amino acid identity to turkey NC 98. The S3 nucleotide and amino acid sequence similarity was < or =61% and 78%-80%, respectively, when compared to the chicken reovirus isolates. Comparison of amino acid sequences from chickens and turkeys with that of a duck isolate revealed a 53% and 55% similarity, respectively. Phylogenetic analyses, based on both nucleotide and amino acid sequence, resulted in three major groups among the avian reoviruses; these groups were clearly separated by species. The results of this study provide further evidence, based on the deduced sigma2 sequence, that turkey reoviruses form a distinct, separate group relative to chicken and duck isolates. In addition, as a result of the limited sequence identity with their avian counterparts, turkey reoviruses could potentially be considered a separate virus species within subgroup 2 of the Orthoreovirus genus.     

2株H3N8亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传变异分析

采用RT-PCR技术扩增了2株H3N8亚型流感毒株A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010的HA和NA基因,并与GenBank中收录的其他毒株序列进行比较分析和遗传进化分析.结果表明,分离株的HA与NA基因全长分别为1 733 bp、1 432 bp.A/du...     

疑有禽白血病病毒混合感染的肉种鸡大肝大脾病

山东某父母代肉种鸡开产后死淘率突然升高,死亡鸡肝脏、脾脏、腺胃等内脏器官肿大,高峰期周产蛋率仅为72%,明显低于同场区未发病鸡群的83%,更显著低于其标准产蛋率（87%）。利用RT-PCR技术对肿大的脏器分别进行分子病原学诊断,禽网状内皮增生症病毒、戊型肝炎病毒和马立克氏病毒等PCR检测结果阴性,而ALV pol基因检测阳性,经测序与GenBank 已发表的ALV E 亚群毒株的核苷酸同源性高达97.5%-99.5%。血清学检测证实, ALV-AB亚群在发病前阳性率为8.3%,而发病后的抗体阳性率则攀升为70%。鸡群发病后的种蛋蛋清p27抗原检测ALV阳性率为5.3%。综上所述,鸡群可能混合感染ALV。     

禽呼肠孤病毒与禽白血病病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列,设计2对引物,在建立鉴别各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立2种病毒的双重RT-PCR。对同一样品中的ARV、ALV核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增ARV 485 bp、ALV 673 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的ARV模板。用31份临床病料对本研究双重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这2种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

禽白血病抗原快速检测试纸条的研制及初步应用

禽白血病给养鸡业带来极大损失,目前检测该病病原的方法主要有ELISA、PCR及RT-PCR、原位杂交(ISH)、间接免疫荧光(IFA)等。本研究应用2株抗禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体5D3和4F12研制了ALV快速检测试纸条。结果证明该试纸条具有良好的特异性,与H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、小鹅瘟病毒、鸡贫血病病毒没有交叉反应;采用p27表达蛋白检测试纸条灵敏性,检测下限达到70ng/mL;应用该试纸条检测71份临床样品,与商业ELISA试剂盒检测结果比较,二者符合率达到93%。该试纸条的研制,为基层快速检测ALV提供了条件。     

七彩山鸡F亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

为了解广东某七彩山鸡种禽场禽白血病流行情况,通过接种DF-1细胞、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)、囊膜基因克隆测序等方法分离并鉴定出两株ALV-F,分别命名为FGD1801和FGD1802。为进一步了解分离株遗传进化特点,利用PCR方法扩增出env基因并测序,同时与各亚群参考毒株的gp85核苷酸序列进行对比。结果显示:这两个分离株env基因gp85片段长度都为1080 bp,预计编码360个氨基酸,FGD1801和FGD1802分离株gp85基因核苷酸序列的相似性为92.8%,与A、B、E、J和K亚群共26株ALV参考毒株相似性在47.0%~64.5%之间,而与F亚群参考株的相似性在92.0%~92.5%,显著高于其他亚群,且位于同一进化分支上。研究表明,从七彩山鸡分离的FGD1801和FGD1802属于ALV-F,是我国华南地区新发现的ALV亚群。     

用IFA和PCR对部分省区肉鸡白血病的调查

从山东省内不同地区和宁夏、河南等省随机采集肉鸡和肉种鸡的病料 ,采用间接荧光抗体实验和 PCR方法进行 J亚群禽白血病的流行病学调查 ,结果从 92份商品代肉鸡病料和 1 5份父母代种鸡病料中先后鉴定出 8株 J-AL V,其中 3株来自商品代肉鸡 ,5株来自父母代肉种鸡 ,感染 AL V-J的肉鸡品系有 AA、科宝和爱维因 ,表明我国肉鸡群中 AL V-J的感染十分严重。     

鸡白血病的流行现状和防制对策

鸡白血病普遍存在于商品鸡群中,呈渐进性发生和持续的低死亡率,白血病毒感染鸡群,导致鸡群生产性能下降,尤其是产蛋率和蛋的品质下降。介绍了鸡白血病病毒和该病在鸡群中的流行现状,分析了病毒间的谱系关系和发病原因,指出鸡白血病与禽网状内皮组织增生症的鉴别诊断方法,科学地提出对鸡白血病的预防和控制措施。     

Molecular characterization of three recombinant isolates of avian leukosis virus obtained from contaminated Marek's disease vaccines

Three natural recombinant avian leukosis viruses (ALV; PDRC-1039, PDRC-3246, and PDRC-3249) expressing a subgroup A gp85 envelope protein and containing long terminal repeats (LTR) of endogenous ALV-E viruses were isolated from contaminated commercial Marek's disease vaccines, cloned, and completely sequenced. Their full genomes were analyzed and compared with representative strains of ALV. The proviral DNA of all three isolates displayed 99.3% identity to each other, suggesting a possible common ancestor, even though the contaminating viruses were obtained from three separate vaccine serials produced by two different vaccine manufacturing companies. The contaminating viruses have a genetic organization typical of replication-competent alpharetroviruses. The proviral genomes of PDRC-1039 and PDRC-3246 are 7497 bp long, and the PDRC-3249 is three base pairs shorter because of a deletion of a threonine residue within the gp85 coding region. The LTR, gag, pol, and the transmembrane (TM) region (gp37) of the env gene of all three viruses displayed high identity to endogenous counterpart sequences (>98%). Only the surface (SU) region (gp85) of the env gene displayed high identity with exogenous ALV-A (98.7%). Locus-specific polymerase chain reaction (PCR) analysis for ALV endogenous sequences (ev loci) in the chicken embryo fibroblasts used to produce the original vaccine vials identified the presence of ev-1, ev-2, ev-3, ev-4, and ev-6 in all three vaccines. Homologous recombination most likely took place to involve the SU region of the env gene because the recombinant viruses only differ in this particular region from the consensus ALV-E. These results suggest that the contaminating ALV isolates probably emerged by recombination of ALV-A with endogenous virus sequences before vaccine preparation.     

表达A亚群禽白血病病毒Gp85蛋白的乳酸菌的构建

本研究旨在构建乳酸菌表达载体以研制A亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A）的活菌疫苗,用于预防禽白血病。使用锚定表达载体构建2株分别表达gp85和gp85-DCpep基因的重组植物乳杆菌,以感染ALV-A的DF-1细胞的基因组DNA为模板,使用PCR方法扩增ALV-A Gp85蛋白的编码基因gp85,将树突状细胞靶向肽（DC-targeting peptide,DCpep）编码基因与gp85基因进行融合,获得gp85-DCpep基因;使用乳酸菌锚定表达载体pSIP409-pgsA’通过同源重组的方法构建重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85;经测序正确后将上述质粒分别电转化植物乳杆菌NC8感受态细胞,获得重组植物乳杆菌;使用SppIP诱导重组植物乳杆菌的表达,收集处于对数生长期的菌体,通过反复冻融获取细胞膜的蛋白样,采用Western blotting技术检测pgsA’-gp85-DCpep和pgsA’-gp85蛋白的表达情况。结果显示,试验成功获得基因片段gp85和gp85-DCpep,构建的重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85测序无突变和丢失情况,并成功电转到植物乳杆菌NC8感受态细胞中,使用SDS-PAGE和Western blotting技术在细胞膜蛋白样中检测到蛋白的表达,大小分别为48.3（pgsA’-gp85-DCpep）和47 ku （pgsA’-gp85）。本试验成功构建了重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85,获得的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和NC8-pSIP409-pgsA’-gp85中的蛋白均成功表达,且具有反应原性,为后期深入研究重组植物乳杆菌在抗ALV-A感染中的保护机制奠定良好的基础。     

我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测

为了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及其与禽网状内皮细胞增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性贫血病病毒(CAV)的混合感染现象,本研究从宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江7个省的39个蛋鸡群收集临床表现和剖检病理变化疑似禽白血病的病料样品184份,采用PCR、病毒分离和IFA检测样品中ALV-J、REV、MDV和CAV。结果表明,7个省蛋鸡场均存在ALV-J感染,病料样品阳性率为60.9%,检测鸡群阳性率为82.1%,与REV、MDV、CAV的混合感染率分别为13.6%、24.5%、22.8%,其中存在较为严重的双重感染(29.0%)和3重感染(18.8%),甚至4重感染(1.7%)。研究结果表明,我国蛋鸡群中普遍存在ALV-J感染,而且与REV、MDV、CAV混合感染严重;提示ALV-J已经可以引起蛋鸡群发病,在临床诊断和致病性研究中,应考虑到多重感染的影响。     

鸭源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及其HA和NA基因的生物信息分析

分离到1株 H5N1亚型高致病性禽流感病毒, 经序列测定发现HA蛋白裂解位点上插入多个连续的碱性氨基酸（PQREIRRKKR*G）,从分子上证实是一株高致病性禽流感病毒。核酸序列比较分析结果表明,分离的流感病毒HA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.8%;NA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1) 和A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.7%。氨基酸水平上,HA与A/duck/Viet Nam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,可达99.3%;NA与A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达98.7%。HA与NA基因的潜在糖基化位点与作者所选参比毒株一致。通过遗传进化树分析结果表明,A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)可能是该毒株的来源株。