家蚕微孢子虫孢子DNA的提取、克隆及部分DNA序列分析

报道家蚕微孢子虫（Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ简称Ｎ．ｂ）孢子ＤＮＡ的提取、克隆及部分ＤＮＡ序列测定的结果。采用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ将孢子破碎，用苯酚一氯仿法提取孢子的ＤＮＡ。将Ｎ．ｂ孢子ＤＮＡ与ｐＴＺ１８Ｒ质粒重组，转化于大肠杆菌ＤＨ５，获得４个阳性克隆株：ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ１，插入片段为１ｋｂ；ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ２，为１．２ｋｂ；ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ３为１．８ｋｂ及ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ４为１．９ｋｂ，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，证实插入的ＤＮＡ片段为家蚕Ｎ．ｂ孢子所特有。与ＭＧ１（Ｎｏｓｅｍａｓｐ．），蓖麻蚕微孢子虫、蓝萤叶甲微孢子虫及蚕卵的ＤＮＡ均无同源性。用双脱氧链终止法测定４个克隆株插入片段的部分ＤＮＡ的序列，经检索尚未发现同源性的基因序列。讨论了ＰＣＲ技术诊断家蚕微孢子虫孢子与近缘种的问题。     

家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究

在ＤＮＡ水平上，以聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｏｎ，ＰＣＲ）技术检测家蚕微孢子虫的结果。设计、合成了两对引物，其中引物Ⅰ是针对家蚕微泡子虫（ＮｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓＮ．ｂ．）引物Ⅱ是针对变形孢子虫（ＶａｉｒｉｍｏｒｐｈａｎｅｃａｔｒｉｘＶ．ｎ，）的。用这两对引物分别对“桑尺蠖微孢子虫”孢子ＤＮＡ和Ｎ．ｂ．（镇江株）的纯孢子及其感染的幼虫、蛹及蛾的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均获得预期的阳性条带；对不同引物扩增的产物进行了ＤＮＡ序列分析。初步认为引物Ⅰ可作为家蚕微孢子虫Ｎ．ｂ．特异性较高的检测引物，而引物１是微孢子虫共有的检测引物。进一步讨论了对家蚕微孢子的检测及分类上的问题。     

家蚕线粒体基因组EcoRⅠ2.0kb片段的克降及序列分析

对家蚕线粒体基因组ＥｃｏＲⅠ２．０ｋｂ片段进行了克隆和序列分析，结果表明该片段包含完整的丝氨酸转移ＲＮＡ基因、ＮＡＤＨ氧化还原酶亚基Ⅰ基因、细胞色素氧化酶ｂ亚基基因的部分序列。与果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）的ｍｔＤＮＡ进行了同源性比较，并根据无脊椎动物线粒体基因组密码子表，推定氨基酸序列。     

产蛋下降综合征（EDS—76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现了１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用Ｂａｍ ＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔ ｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤ     

家蚕蛹线粒体DNA EcoRI 1.9kb片段的克隆及序列分析

克隆了二化性家蚕蛹体的线粒体ＤＮＡ ＥｃｏＲ Ｉ酶解１．９ｋｂ片段，并进行了序列测定。结果表明：克隆片段中包含完整的线位体赖氨酸转移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ－Ｌｙｓ）基因、天冬氨酸转移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ－Ａｓｐ）基因、ＡＴＰ合酶亚基Ⅷ基因和细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ⅱ、ＡＴＰ合酶亚基Ⅵ基因的部分序列。并与果蝇线粒体ＤＮＡ的同源性和参照果蝇线粒体ＤＮＡ密码子翻译的氨基酸顺序进行了比较，由ｔＲＮＡ的一级结构推断出可能     

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应     

副结核分枝杆菌DNA探针的制备与应用

以溶菌酶、ＳＤＳ、高氯酸钠等处理提取副结核分析杆菌Ｃ２株染色体ＤＮＡ，经限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ消化后，以质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ为载体，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转入Ｅ。ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ受体菌中，构建了副结核菌Ｃ２株的ＤＮＡ基因文库。应用反向杂交试验，从基因文库中筛选出４个重组克隆：ＰＴＰ１２、ＰＴＰ１９、ＰＴＰ３８。对这４个重组克隆进行酶切、电泳分析，结果表明４个插入片段长度分别为：４     

不同传染性法氏囊病病毒分离株VP2基因部分核酸序列及其编码蛋白的比较

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列,在病毒 Ｖ Ｐ２ 区域,设计 １ 对引物,并在 ２ 引物上分别加 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ酶切位点。对 ２ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 分离株 Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,然后进行逆转录和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列。将测定的分离株与标准对照株（ Ｓ１） Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｖ Ｐ２ 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, Ｊ Ｓ３ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ３ 与 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９９％ 。推导编码蛋白氨基酸序列, Ｊ Ｓ３ 和 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９６％ , Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９８％ 。这表明在我国流行的 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定

纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液,通过ＰＣＲ技术,从病毒ＤＮＡ中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３完整编码基因。将该ＰＣＲ扩增片在ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅡ位点克隆进ｐＵＣ１８质料载体,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３,进一步对该片段进行序列及用ＣＬＯＮＥ软件分析该序列。结果结盟,其与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ３编码基因的克隆。     

家蚕病原性微孢子虫孢子表面蛋白的选择性分离与总蛋白比较分析

选择性分离了Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ孢子表面蛋白和总蛋白，采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测发现，孢子表面蛋白由分子量不同的３种亚基（３２０００、２６０００、２４５００Ｄａ）组成，其总蛋白至少包括２５个条带。同时将从养蚕生产中收集到的两种微粒子ＭＡ－１和ＭＤ－１以及从野外昆虫收集到的微孢子虫Ｐｈａ－Ｍ和Ｈａ－Ｍ与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较，发现不同微孢子虫间蛋白组成有差异。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)交叉感染的孢子形态变化及表面蛋白差异

试验探讨了微孢子虫的交叉感染性与孢子表面蛋白的变化。结果表明,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)转主感染桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)后孢子形态变为细长,分离纯化感染前和感染后的孢子表面蛋白,通过SDS-PAGE电泳发现形态变异株出现了34 kD和67 kD的差异带,在相同条带17、30、47、77和114 kD表达量存在明显的差异,但33 kD和43 kD条带表达量没有差异。孢子表面蛋白的差异性表达可能与微孢子虫感染适应性有关,而33 kD和43 kD可能是微孢子虫共有的保守蛋白。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

云南保种山羊线粒体DNA限制性酶切研究

采用碱变性法,提取来自云南省不同地区４个保种山羊的１３个个体的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）,并用ＡｐａⅠ,ＡｖａⅠ,ＢａｍＨⅠ,ＢｃｌⅠ,ＢｃＩⅠ,ＢｇｌⅡ,ＣｌａⅠ,ＤｒａⅠ,ＥｃｏＲⅠ,ＥｃｏＲⅤ,ＨａｅⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＫｐｎⅠ,ＰｓｔⅠ,ＰｖｕⅡ,ＳａｃⅠ,ＳａｌⅠ,ＳｍａⅠ,ＳｔｕⅠ和ＸｈｏⅠ等２０种限制性内切酶进行酶切分析。结果发现它们的线粒体ＤＮＡ的分子量大小约为１５．８Ｋｂ;不同限制性内切酶的酶切位点分别为：ＤｒａⅠ有７个酶切位点,ＡｖａⅢ有６个酶切位点,ＥｃｏＲⅤ和ＳｔｕⅠ共有５个酶切位点,ＨｉｎｄⅡ和ＨａｅⅡ有４个酶切位点,ＢａｍＨⅠ,ＢｇｌⅡ,ＰｓｔⅠ和ＰｖｕⅡ有３个酶切位点,ＡｐａⅠ,ＣｌａⅠ有两个酶切位点,其余有１个酶切位点。各保种山羊间未发现变异,说明云南的４个保种山羊极可能来自于共同的母性祖先。     

两种微孢子虫孢子表面蛋白及对家蚕侵染性的比较研究

对来自家蚕的内网虫属样微孢子虫和家蚕微孢子虫的形态、表面蛋白及侵染性进行了比较研究。内网虫属样微孢子虫孢子显著小于家蚕微孢子虫 ,孢囊中孢子数为 8～ 32个 ,只侵染中肠组织 ,对家蚕无胚胎传染性。SDS UreaPAGE和 2D PAGE图谱显示两种孢子表面蛋白有明显差异。在SDS UreaPAGE中 ,内网虫属样微孢子虫的主要表面蛋白为 2 2kD ,而家蚕微孢子虫为 4 5kD。 2D PAGE显示 ,当上样量为 12 0 μg时 ,内网虫属样微孢子虫孢子表面蛋白斑点有 330多个 ,而家蚕微孢子虫孢子只有 16 0多个 ,其中仅有 10多个相同或疑似蛋白点。家蚕微孢子虫的主要表面蛋白点约有 2 0个 ,以中性偏酸的小分子居多 (<18kD ,pI 5 .4～ 7.2 ) ;内网虫属样微孢子虫有 30多个 ,分布较分散。根据两种孢子都能感染家蚕的特点 ,认为相同或疑似蛋白与是否能够感染有关 ,而大量差异蛋白与对家蚕的感染程度有关。两孢子表面蛋白中的主要蛋白均为差异蛋白 ,可能是孢子表面的结构蛋白。     

不同地域来源的家蚕微孢子虫DNA特异片段序列及同源性分析

利用碱裂解方法抽提到山东株系的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)的基因组DNA ,通过PCR技术扩增得到了N .b的一段特异的DNA片段 ,经测序发现 ,该片段大小为 317bp。将其与日本株N .b和广东株N .b的序列比较得知 ,山东株N .b和广东株N .b ,山东株N .b和日本株N .b ,以及广东株N .b和日本株N .b之间的序列同源性分别为 94 .0 0 %、96 .2 1%、92 .11%。进一步聚类分析发现 ,山东株N .b和日本株N .b之间的亲缘关系更接近     

水貂阿留申病毒NS1基因在大肠杆菌中的分段表达

利用DNAStar Protean模块预测分析水貂阿留申病毒（aleutian disease virus,ADV）NS1基因后,设计3对特异性引物,以吉林农业大学经济动物实验室保存的NS1全长克隆质粒NS1-pMD18-T为模板扩增NS1基因的3个截短片段,分别命名为L1N1、L2N2、L3N3基因,构建克隆质粒pMD18-T-L1N1、pGEM-T-L2N2及pMD18-T-L3N3。经测序鉴定正确后,将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的3个NS1基因片段连接至经相同双酶切的pGEX-4T-1原核表达载体,并转化入表达宿主菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,成功构建了3段重组原核表达质粒pGEX-4T-L1N1、pGEX-4T-L2N2、pGEX-4T-L3N3,SDS-PAGE结果显示分别表达出大小约57、51、44 ku的目的条带,与预期相符。Western blotting 进一步证实获得的3种蛋白能被ADV阳性血清识别,具有反应原性。本试验首次对ADV NS1基因在大肠杆菌中进行分段表达,为后续研制ADV的亚单位疫苗奠定基础。     

广消威对家蚕微孢子的消毒效果及机理研究

研究了含氯消毒药剂广消威对家蚕微孢子的杀灭效果。结果表明 ,广消威可有效杀灭家蚕微孢子 ,并且具有药效稳定、对金属腐蚀性弱等优点。对广消威的消毒机理进行了探讨 ,认为广消威不仅可以破坏家蚕微孢子的结构 ,而且还可使微孢子的可溶性糖大量外渗和蛋白质结构受到破坏 ,从而使微孢子失去致病能力     

禽腺病毒贵州分离株ＨＳ—１的核酸酶切分析与蛋白抗原鉴定

本研究利用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗestern-Blotting技术鉴定３株不同的减蛋综合征病毒（贵州株ＨＳ－１、南京分离毒ＧＣ２、国际标准毒ＡＶ－１２７）的蛋白抗原性，结果表明，３株毒的蛋白多肽分子量均在１０６－１２kＤ范围,一各条多肽的组成上略有差异；它们都具有两条相同的免疫原性多肽，分子量分别为１０６和１００ＫＤ。同时，运用ＥcoRⅠ,HindⅢ，ＰｓｔⅠ和ＳmaⅠ等５种限制性内切酶进行了酶切分析，证实３株ＥＤＳ病毒用ＰstⅠ和ＳmsⅠ酶切的片段大小及长度略有不同，而其它３种酶的酶切图谱完全相同。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。