一种提取细胞结合性马立克病毒基因组的新方法及其高效转染

马立克病毒(Marek′s disease virus,MDV)是一种高致瘤性α-疱疹病毒,基因组为166～184 kb的线状双股DNA,同时因为其严格的细胞结合性特点,如何分离纯化病毒DNA,一直阻碍人类对MDV的研究.常规方法制备的病毒基因组中含有大量的细胞基因组,不利于高效转染.通过密度梯度离心法从宿主细胞中分离MDV DNA,由于MDV DNA的浮密度与宿主细胞基因组相近,所以制备时也有细胞DNA的污染[1-2].Robin等用脉冲电泳的方法分离MDV基因组[3],虽然完全去除了宿主细胞基因组,但是这种方法对设备和技术要求都较高,所以没有得到推广.因此发展一种新的提取纯化MDV基因组方法对于MDV的分子生物学研究至关重要.     

鸡对马立克氏病病毒免疫应答的转录组和蛋白质组研究

近年来兴起的病毒基因组或部分目的基因以及蛋白表达分析技术,为人们更好地认识宿主对马立克氏病病毒(MDV)的免疫应答机制提供了有利帮助。本文主要综述了从转录组学和蛋白质组学开展的有关MDV致病机理、宿主对MDV反应、MD遗传抗性或易感性以及疫苗诱导的免疫反应等方面的最新研究进展,并讨论了应用miRNA以及RNAi技术对基因、蛋白和信号通路在MDV与宿主相互作用中发挥重要作用的效应单位进行功能分析。     

鸡对马立克氏病病毒免疫应答的录组和蛋白质组研究

近年来兴起的病毒基因组或部分目的基因以及蛋白表达分析技术,为人们更好地认识宿主对马立克氏病病毒(MDV)的免疫应答机制提供了有利帮助.本文主要综述了从转录组学和蛋白质组学开展的有关MDV致病机理、宿主对MDV反应、MD遗传抗性或易感性以及疫苗诱导的免疫反应等方面的最新研究进展,并讨论了应用miRNA以及RNAi技术对基因、蛋白和信号通路在MDV与宿主相互作用中发挥重要作用的效应单位进行功能分析.     

miRNA可作为马立克氏病病毒感染和肿瘤发生的标记

正鸡马立克氏病是家禽养殖过程中常见的传染性疾病,马立克氏病病毒(MDV)是引发该病的罪魁祸首。新的研究发现,microRNA(miRNA)对MDV肿瘤发生有调节作用。为更深入了解MDV肿瘤发生的分子机制,来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的科研团队对MDV易感个体的宿主和病毒miRNA表达谱进行了研究。研究人员采用miRNA芯片技术(miRNA芯片分析项目由联川生物承担完成)分析了MDV感染     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

利用CRISPR/Cas9技术缺失MDV分离株meq基因的研究

鸡马立克氏病病毒(MDV)是一种能够引起鸡肿瘤的疱疹病毒,具有严格的细胞结合特性,对其基因组编辑较为困难。研究利用CRISPR/Cas9技术对中国MDV分离株基因组中的meq基因进行缺失。依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列,设计了8条靶向meq基因的小向导RNA(sgRNA),分别克隆到pX330质粒中,构建表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeqsgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果,选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞(CEF)上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒,接种MDV分离株BS/15株,通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株,成功克隆到一株meq基因缺失株。序列分析证明获得的MDV重组毒株确定meq基因序列已被敲除。体外试验证明该MDV重组毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法,为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。     

电子显微镜技术对马立克氏病病毒的监测

为了及时监测马立克氏病病毒(MDV)在培养、驯化及制苗过程中其他微生物的污染,我们利用电子显微镜技术对送检材料进行了监测.结果在不同批次的送检材料中分别发现了支原体、网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、鸡贫血病痛毒等,表明利用电子显微镜技术可以对MDV培养物的纯度进行直观快速的检测.     

马立克氏病毒强毒GD0908株感染性克隆的构建

为研究马立克氏病毒(MDV)新型疫苗及MDV致病机理,将MDV强毒GD0908株的全基因组作为细菌人工染色体(BAC)转化进大肠杆菌,构建GD0908株的感染性克隆.利用同源重组将BAC载体插入MDV基因组的US2区,将包含BAC载体的MDV DNA电转化入大肠杆菌菌株DH10B,最后将鉴定成功包含GD0908株全基因组的BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),成功拯救出重组病毒,命名为rGD0908,其与父代病毒GD0908株在CEF细胞上的生长速度没有差异.该感染性克隆将为MDV的相关研究提供技术平台.     

MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失BAC克隆株的构建及其体外增殖特性

为构建缺失马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs的突变株,本研究在vv MDV GX0101细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆的基础上,采用Red/ET同源重组技术将Meq-clustered miRNAs的编码基因进行缺失突变,经PCR鉴定及序列分析证明Meq-cluster miRNAs序列成功缺失后,提取Δmeq-miRNAs BAC DNA,转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,用SYBR GreenⅠqRT-PCR检测病毒体外增殖特性。结果表明成功拯救出缺失MDV Meq-clustered miRNAs基因的感染性BAC克隆株GX0101Δmeq-miRNAs,且该缺失株与亲本株GX0101BAC具有相似的增殖曲线,Meq-clustered miRNAs是MDV体外复制的非必需基因。MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失感染性BAC克隆株的成功构建为进一步研究MDV Meq-clustered miRNAs在MDV致病和致肿瘤方面的作用奠定了基础。     

安全性,免疫效力双重把控——鸡马立克氏病活疫苗(CVI988/Rispens株)

正鸡马立克病(Marek`s disease,MD)由疱疹病毒科的马立克氏病病毒(MDV)引起,MDV具有与宿主细胞结合的能力。鸡是MDV的自然宿主,其次火鸡、野鸡、珍珠鸡等均可自然感染。鸡MDV不易被控制是由于MDV感染鸡只会终生排毒,体内发育成熟后(2~3周)的MDV会随着髓羽根部脱落的皮屑在自然的环境中广泛传播,积存于孵化室、