BHK-21细胞悬浮驯化及对新城疫病毒悬浮培养工艺研究

为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。     

O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒3A基因序列分析

为了对缅甸98谱系O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒的3A编码基因序列及其氨基酸序列进行分析,从而研究O型口蹄疫病毒的演化、变异情况,将O型口蹄疫病毒株O/XJ/10-11接种于牛、乳鼠、猪及BHK-21细胞,获得相应的适应毒,以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增3A基因,采用Vector NTI 11.5和DNA Star生物学软件对3A基因进行比对分析。结果表明:牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞4种宿主适应毒,3A基因较稳定,变异较少;变异均发生在3A的第99、114位氨基酸上,说明FMDV 3A基因的第99、114位氨基酸在一定程度上与宿主嗜性有关。本试验结果为进一步分析O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒基因组的变异奠定了基础。     

口蹄疫病毒诱导BHK-21细胞产生凋亡的研究

试验利用口蹄疫病毒感染BHK-21细胞,通过MTT法、Hoechst 33258染色、原位末端标记技术(TUNEL)、流式细胞术和链特异性荧光定量RT-PCR,分别就口蹄疫病毒对BHK-21细胞生长的抑制作用、凋亡细胞的形态学和分子生物学特征、凋亡峰的出现和细胞周期的变化以及口蹄疫病毒基因组在BHK-21细胞内的复制情况进行了检测。结果表明:口蹄疫病毒可抑制BHK-21细胞的生长并诱导其产生凋亡,呈现典型的凋亡细胞特征,出现细胞凋亡峰并且细胞周期明显被阻滞在G1/G0期,同时对凋亡率和口蹄疫病毒基因组复制的关系做了初步研究。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

应用Cephodex微载体规模化生产伪狂犬病疫苗的研究

为实现伪狂犬病病毒(PRV)的大规模生产,本研究应用Cephodex微载体悬浮培养BHK-21细胞,通过对培养工艺的研究,初步实现了病毒抗原的高效生产。整个过程采用流加方式和动物细胞微载体培养技术,在细胞反应器中进行BHK-21高密度培养和PRV的高滴度增殖。结果表明,微载体工艺比转瓶培养法获得的病毒液滴度高约100.525TCID50/0.1 m L。因此,应用Cephodex微载体悬浮培养BHK-21细胞在伪狂犬病疫苗规模化生产中具有重要的应用价值。     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因的差异分析

为了明确O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因位点的差异性,研究其遗传变异趋势,找出不同宿主适应毒株在P1和3A基因水平上位点的变异情况,将O型口蹄疫病毒O/XJ/10-11株分别接种于牛、乳鼠、猪及BHK-21细胞,获得相应的宿主适应毒株,提取RNA,反转录并扩增P1和3A基因,目的片段产物经琼脂糖凝胶电泳回收,并将其克隆到pMD19-T载体上,筛选阳性菌落,测序并分析其基因序列。结果表明:牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞四种宿主适应毒株,核苷酸和氨基酸序列均未发生缺失,主要抗原位点稳定;P1基因发生了部分变异,变异程度依次为VP1、VP2VP3VP4,VP4基因最为保守;3A基因较稳定,变异较少;不同宿主适应毒株的变异程度依次如下:猪适应毒株BHK-21细胞适应毒株牛适应毒株鼠适应毒株。O型口蹄疫病毒在不同宿主传代过程中造成VP1基因的变异,但主要抗原位点稳定;VP2基因的变异均位于抗原表位上;鼠适应毒株作为口蹄疫原始毒种的保存更为有利。     

Asia1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组.待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析.结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个.感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个.结果表明FMDV感染BHK-21细胞后弓l起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果.本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制.     

金丝桃素体外抗口蹄疫病毒与宿主细胞吸附作用研究

对光活化金丝桃素体外抑制口蹄疫病毒与宿主细胞吸附作用进行实验。体外培养的BHK-21细胞加入金丝桃素,日光灯下光活化1h后感染FMDV。通过细胞病变观察、MTT法、双抗体捕获抗原法、扫描电子显微镜进行抑制FMDV与宿主细胞吸附、融合研究。结果表明金丝桃素有明显抑制细胞病变的作用。双抗体捕获抗原法检测金丝桃素有效抑制FMDV和BHK-21细胞的吸附、融合,抑制率可达59．72％。扫描电镜观察,金丝桃素组与病毒对照组相比,BHK-21细胞FMDV颗粒明显减少。提示金丝桃素在体外有显著抑制口蹄疫病毒与宿主细胞的吸附、融合作用。     

增效助悬剂对堆型艾美耳球虫活卵囊免疫效果的影响

为检验本课题研制的球虫疫苗免疫增效助悬剂对疫苗免疫效果的功效。通过测定免疫攻毒鸡的相对增重率、死亡率、病变记分、卵囊减少率等来观察和分析鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂对疫苗免疫产生期的影响。结果显示,与饮水对照组相比,增效助悬剂组的相对饮水率为105.89%;一次免疫,增效剂免疫组和免疫对照组鸡群已能对大剂量强毒株攻击产生保护力,但病变记分均≥1,相对增重未达到80%,未达到良好免疫效果;二次免疫,增效剂免疫攻毒组于二免后第6天产生良好免疫保护,免疫对照组于二免后第7天达到良好免疫效果。表明球虫疫苗免疫增效助悬剂不影响雏鸡饮水,且使用该助悬剂可缩短免疫产生期。     

产气荚膜梭状芽孢杆菌气悬状态下存在形式的研究

产气荚膜梭状芽孢杆菌是动物舍空气粪便污染的指示菌种,他们的含量反映了动物舍卫生状况以及动物体相应疾病的可能感染。通过对 Ｋ Ｓ９２ 喷冲器空气样品加热 ８０℃,２０ 分钟处理,结果证明该菌群几乎 １００％ 以芽孢形式气悬存在。     

草原文化是华夏文化的活泼元素

游牧是草原文化的基本元素。保存草原文化,就要给游牧以适当的地位。游牧是人类最早的仿生学,其合理内核可为农业现代化作贡献,不可一概视为落后而废除。草原文化从徒步游牧到骑马游牧,是一大进步,对人类文化的沟通交融作出了的重大贡献。一旦草原文化与农耕文化融合,发生系统耦合效应,将产生生态的、经济的巨大变革,从而导致文化的飞跃。我们不妨称为‘文化造山运动’。草原文化在华夏文化发展史中始终是活泼元素。人类文明将离不开草原文化的支撑。     

不同培养基对小鼠胚胎干细胞培养的影响

探讨了培养基中各组成(基础培养基、添加物、血清)对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)培养的影响.结果如下:GMEM与DMEM这2种基本培养基在对ES细胞维持培养上差异不显著.GMEM 18%血清 4mmol/L谷氨酰胺 0.1mmol/L非必需氨基酸、DMEM 18%血清 4mmol/L谷氨酰胺 0.1mmol/L非必需氨基酸以及DMEM 18%血清,这3种培养基都有较好的对ES细胞维持培养能力.在培养基中不需要额外添加谷氨酰胺和非必需氨基酸.血清浓度会直接影响ES细胞培养效果,应使用18%的优质血清.     

论草文化

从古至今、从国内到国外论述了草文化的起源、发展历史与过程,阐述了草与人类社会发展的密切关系.文献资料表明,中国在先秦时代就出现了草文化,在唐宋时代锦上添花,如今更是丰富多彩了.丝绸之路是草原文化与中原文化、中国文化与外国文化交流的纽带.草文化和草原文化在一代一代的劳动人民中流传下来,并得以发扬光大.草文化无国界,世界各地都能找到丰富多彩的草文化,草和草文化早已成为人们生活中不可缺少的一部分.     

Use of blood culture medium enrichment for synovial fluid culture in horses: A comparison of different culture methods

Reasons for performing study: Standard methods for culturing equine synovial fluid (SF) are often unrewarding. Evidence‐based information on the relative efficiency of different systems used for optimisation of isolation of microorganisms from equine SF is lacking. Objectives: To compare the results of different culture systems performed in parallel on SF samples from horses clinically diagnosed with synovial sepsis. Methods: Synovial fluid specimens were collected between February 2007 and October 2008 from all horses admitted to a referral hospital that were clinically diagnosed with synovial sepsis and from control horses. Synovial fluid samples were cultured in parallel by: 1) direct agar culture (DA); agar culture after: 2) lysis‐centrifugation pretreatment (LC); 3) conventional enrichment (CE); 4) combined LC/CE; or 5) blood culture medium enrichment using an automated system (BACTEC 9050). Results: Ninety SF samples from 82 horses were included, together with 40 control samples. Seventy‐one of 90 samples (79%) were culture‐positive by using blood culture medium enrichment (BACTEC), which was significantly higher compared to all other methods. BACTEC enrichment was never negative while any of the other methods was positive. Although agar culture following LC and/or CE resulted in a slightly higher number of positive samples compared to DA, this difference was not significant. All control samples were culture negative by the 5 different techniques. Although the majority of samples containing isolates recovered without enrichment, culture results after BACTEC enrichment were available on the same day as for agar culture with or without LC (19/23 samples), while CE postponed recovery by at least one day in 20/23 samples. Conclusion: Blood culture medium enrichment is superior to other techniques for isolation of bacteria from SF of horses. The use of an automated system allows enrichment without substantially postponing recovery of microorganisms. Potential relevance: The efficient and fast isolation of microorganisms from infected SF by the BACTEC system allows for rapid susceptibility testing and a more appropriate antibiotic treatment.     

培养基不同制造工艺对细菌培养效果的影响

用传统工艺和改进工艺制备培养基,进行大肠杆菌的培养,比较不同制备工艺对细菌培养效果。结果：在其他培养条件相同情况下,用传统工艺制备培养基培养三批大肠杆菌,其活菌数分别是4.6×10^5、5.2×10^5、3.9×10^5;平均4.57×10^5。用改进工艺制备培养基培养三批大肠杆菌,其活菌数分别是8.2×10^5、8.6×10^5、8.0×10^5;平均8.27×10^5。后者比前者增加活菌数3.7×10^5。     

饲料企业制度层文化与精神层文化的兼容性研究

企业制度层文化和精神层文化是饲料企业文化的重要组成部分,两者对饲料企业行为层文化和物质层文化具有决定性作用。兼容性是企业制度层文化与精神层文化关系研究中首先要解决的关键问题。文中在对这个问题分析的基础上,进一步使用系统论的方法研究了饲料企业精神层文化与企业制度层文化在兼容情况下与不兼容情况下的关系,并针对处于企业制度层文化和企业精神层文化不兼容状态中的饲料企业,提出了相应的对策建议。     

Uterine culture in mares

A guarded, sterile swab is used to obtain samples for uterine culture. With the mare in stocks, the tail bandage and the perineum washed, the culture rod is introduced into the vagina with a gloved hand. After the rod is guided through the cervix, the guard cap is dislodged and the swab is rubbed along the endometrium, after which the rod is extracted. Samples for uterine culture should only be obtained during full estrus. Swabs should be directly plated onto agar within 2 hours of collection. Blood agar is appropriate for initial screening, but use of specialized types of agar expedites identification of microbes. Plates are incubated at 37 C and inspected for growth every 12 hours. The type and number of bacterial colonies should be coupled with the history and clinical signs in deciding on the necessity and type of treatment. Pure, heavy bacterial growth is usually accompanied by clinical signs of infection. Interpretation of the significance of moderate bacterial growth may be aided by cytologic examination of endometrial smears, made by rolling the swab onto a glass slide and staining with Diff - Quik . Large numbers of neutrophils indicate the need for antibiotic therapy. Mixed bacterial growth and variable numbers of neutrophils usually indicate faulty sampling technic. Microaerophilic or anaerobic cultures may aid diagnosis in cases of equivocal aerobic culture results.