多重PCR鉴定三种颚口线虫方法的建立

为了建立快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫虫种的方法,根据GenBank中发表的棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫ITS-2序列,设计了3对特异引物,建立了这3种颚口线虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了鉴定。结果显示单一PCR和多重PCR均能特异扩增出棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫,其片段大小分别为282、358、183 bp,单一PCR对棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫虫体DNA最小检出量分别为0.2、0.01、0.01 ng/μL。对宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫以及迭宫绦虫均不能进行扩增。用建立的多重PCR方法对菲律宾、印度尼西亚、黑龙江颚口线虫等12条颚口线虫DNA模板进行扩增,经鉴定菲律宾与印度尼西亚的颚口线虫为棘颚口线虫,黑龙江的颚口线虫为日本颚口线虫。鉴定结果与原虫体样本的形态鉴定和测序分析结果一致。研究显示建立的多重PCR方法具有很强的特异性和较高的敏感性,可用于棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫虫种的鉴定和流行病学调查。     

湖南省野猪杜氏颚口线虫线粒体cytb基因序列种系发育分析

为阐明野猪杜氏颚口线虫分离株线粒体细胞色素b(cytb)基因的遗传变异情况,并利用该基因探究杜氏颚口线虫与其它线虫的种群遗传关系。本研究利用PCR扩增从野猪体内分离出的杜氏颚口线虫cytb基因,并对该基因序列进行分析。结果显示,8株杜氏颚口线虫分离株线粒体cytb基因序列长度均为1 067 bp,与Genbank中登录的杜氏颚口线虫分离株同源性均大于98.3%,与其它线虫的同源性均小于72.0%;通过该基因建立的系统发育树分析显示,所有的杜氏颚口线虫分离株均与已知杜氏颚口线虫属于同一大分支。表明,线粒体cytb基因序列种内相对保守,种间差异明显,可以作为分子标记应用于杜氏颚口线虫的种间遗传变异研究。本研究为杜氏颚口线虫的分子流行病学和群体遗传学奠定基础。     

出口泥鳅颚口线虫病的检疫

颚口线虫可以寄生于多种动物体内,引起各种病变,也可以寄生于人体,引起移动性线状发疹的颚口线虫症(Creeping disease)。日本人喜欢生吃泥鳅,已有许多该虫引起发病的报道。舟山口岸每年有近50批次约20吨泥鳅出口日本,根据双方约定,泥鳅不得带有颚口线虫。     

辽宁绒山羊毛尾线虫的分子鉴定与遗传进化分析

为了确定辽宁绒山羊毛尾线虫的种类及遗传进化关系，以来自辽宁省东部山区的10株辽宁绒山羊源毛尾线虫为研究对象，采用PCR技术对其核糖体基因组内转录间隔区（ITS）进行扩增并测序，然后将测序结果与GenBank中公布的其他动物毛尾线虫进行同源性分析并构建系统进化树。结果显示：10株虫体的形态结构均符合毛尾线虫特征，10株毛尾线虫的ITS1序列长度基本一致，约为445 bp；与GenBank中登录的2株中国岩羊毛尾线虫同源性最高，分别为95.5%～100%和93.7%～98.7%；系统进化树分析显示，10株绒山羊毛尾线虫样品与2株中国岩羊毛尾线虫聚集在同一分支上，种内差异（0～2.1%）远小于种间差异（23.6～50.6%）。结果表明，本次从辽宁绒山羊体内分离到的线虫为毛尾线虫，同时也证实其核糖体ITS序列种内相对保守，可以作为毛尾线虫的分子鉴定及遗传进化研究的目的基因。     

蛇钩口线虫长沙分离株ITS基因的克隆及序列分析

为研究蛇钩口线虫长沙分离株的核糖体DNA (rDNA)内转录间隔区(ITS)序列的遗传变异情况,并利用ITS序列构建蛇钩口线虫与其它线虫的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增蛇钩口线虫rDNA的ITS片段,并克隆至pGEM-T载体中进行序列测定及分析.结果显示,长沙市各分离株的ITS序列长度均为734 bp,与其它线虫的同源性均低于83.9％,而与十二指肠钩口线虫的同源性较高.本研究为蛇钩口线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

泥鳅中刚刺颚口线虫寄生的调查

<正> 刚刺颚口线虫是猪的一种胃寄生虫,也能寄生于人体。Morita等(1984)报告人因食用从中国大陆和台湾以及朝鲜进口的泥鳅而感染刚刺颚口线虫病的病例。日本Takakura等(1985)从进     

美国多花黑麦草种子中致死粒线虫的检疫鉴定

致死粒线虫(Anguina funesta)是具有重要经济意义的粒线虫，被多国列入检疫性有害生物名录。2021年，上海口岸从来自美国的多花黑麦草(Lolium multiflorum)种子中截获一种粒线虫属线虫，但在该样品中仅分离得到幼虫，无法准确鉴定。本研究运用形态学与分子生物学相结合的方法对分离得到的幼虫进行鉴定。采用28S通用引物扩增该线虫序列，测序获得742 bp的序列，与GenBank中登录的致死粒线虫相似性达100%；采用ITS通用引物对ITS区扩增并测序，获得778 bp的序列，与GenBank中登录的致死粒线虫相似性达99.86%～100%。基于28S及ITS区序列构建的系统进化树均显示，该线虫与致死粒线虫位于同一进化枝上。综合形态学特征及分子鉴定结果，将该群体鉴定为致死粒线虫。这是我国口岸首次报道截获该线虫，本研究将为口岸检疫部门鉴定该线虫提供技术参考。     

猪毛尾线虫的检测及其ITS序列分析

毛尾线虫俗称鞭虫,为肠道常见寄生线虫,可感染人和多种动物。2015年11月,江西某猪场育肥猪出现腹泻症状,粪便带黏液和血液,部分病猪死亡;剖检发现猪肠道内充满了线状虫体;依据发病猪症状和虫体、虫卵的分析,初步确定该病为猪毛尾线虫病。采用通用引物扩增分离线虫的基因组内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS),结果显示分离虫体的ITS序列与猪毛尾线虫ITS序列的核苷酸同源性高达99.8%,从基因水平进一步证实了该病原为猪毛尾线虫;系统进化分析表明其与18条来自不同地区毛尾线虫的ITS序列相似性均93.5%,其中,与湖南益阳地区的猪毛尾线虫(AM993005)亲缘关系最近。试验结果为建立猪毛尾线虫的分子生物学诊断方法奠定了基础。     

爱普利注射剂对放牧绵羊体内外寄生虫的驱虫试验

应用爱普利注射剂,选择自然感染线虫和体外寄生虫的1.5岁放牧藏系绵羊100只,分别按0.1、0.2、0.3 mg/kg.b w剂量皮下注射给药,同时设伊维菌素注射剂药物对照组和阳性对照组,评价驱除放牧绵羊体内线虫与体外寄生虫的效果。结果显示:爱普利注射剂0.2、0.3 mg/kg剂量对放牧绵羊消化道线虫虫卵转阴率分别为95.0%和100.0%,减少率分别为98.4%和100.0%;网尾线虫幼虫转阴率和减少率均达100.0%,原圆科线虫幼虫转阴率分别为90.0%和100.0%,减少率分别为96.1%和100.0%;对主要线虫虫卵(幼虫)的平均有效率分别达98.0%和100.0%;第7d对绵羊颚虱、足颚虱的转阴率、杀虫率均达100%;对羊蜱蝇的转阴率分别为90.0%和100.0%,杀虫率分别达92.3%和100%;均达到了高效。爱普利注射剂0.1 mg/kg剂量对线虫虫卵(幼虫)的转阴率、减少率及对体外寄生虫的杀虫率均次于0.2、0.3 mg/kg剂量组。对照药物伊维菌素注射剂0.2 mg/kg剂量消化道线虫虫卵转阴率、减少率分别为95.0%和97.8%;网尾线虫幼虫转阴率和减少率均达100.0%,原圆科线虫幼虫转阴率、减少率分别为85.0%和94.3%;第7d绵羊颚虱、足颚虱的转阴率、杀虫率均达100%;羊蜱蝇转阴率、杀虫率分别为80.0%和90%。阳性对照组线虫虫卵(幼虫)与给药前无明显变化、3种体外寄生虫感染情况较给药前略有增加。绵羊皮下注射3个剂量爱普利注射剂,未出现任何异常反应。试验证明爱普利注射剂3个剂量对藏系绵羊线虫虫卵(幼虫)、3种体外寄生虫均有效,其中0.2 mg/kg剂量驱除放牧绵羊线虫高效安全经济。     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

广东省4株PCV2型分离株全基因组进化分析

【目的】 了解目前广东省猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）分离株的基因型和进化特征,为广东省PCV2防控及疫苗株的筛选提供参考依据。【方法】 运用PCR方法将4份鉴定为PCV2阳性样品进行PCV2全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析;利用MegAlign软件对4株PCV2广东分离株ORF2氨基酸序列与国内外参考毒株进行关键位点氨基酸变异分析;应用DNAStar中Protean软件的Jameson-Wolf方法对4株PCV2广东分离株ORF2基因编码的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数预测分析。【结果】 测序结果表明,4株PCV2广东分离株序列长度均为1 767 bp。遗传进化树结果表明,4株分离株均属于PCV2d基因型,且核苷酸相似性在97.7%~99.1%之间,与国内外54株参考毒株相似性在91.7%~99.8%之间,其中与PhuTho/G40312/2018株（Viet Nam,登录号：LC602996）、QZ1410株（江苏,登录号：MG732832）、GXBB1501211株（广西,登录号：MH756609）亲缘关系最为接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有8个氨基酸特异性突变位点,分别是Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E、R169G及T216A。抗原指数分析发现,广东省分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第7－12、47－53、80－90、160－170和205－213位氨基酸这5个区域。【结论】 从广东省部分地区分离的4株PCV2均为2d亚型,其Cap蛋白氨基酸序列存在多个突变位点,抗原指数与疫苗株差异较大,提示广东省PCV2的流行趋势逐渐以2d亚型为主。     

华东地区PMWS患病猪群PCV-2的检测及其基因特征

用 PCR方法 ,对江苏、上海、山东、江西、安徽和浙江等省市 6 5家猪场 99例断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)肺脏和淋巴结病料 ,进行了猪圆环病毒 - 2 (PCV- 2 )基因检测 ,发现其中 18家猪场 2 1例病料为 PCV- 2阳性。源自安徽和上海的 PCV- 2分离株经基因序列分析显示 ,2个分离株部分 ORF2 与国外分离毒株同源性为 92 %～99%。安徽分离株 AHHF6与韩国分离株 KSY- 1同源性为 99% ,而上海分离株 SHHT1与加拿大分离株 Imp.114 7同源性为 98%。上述结果表明 ,我国 PMWS患病猪群广泛存在 PCV- 2 ,不同地区 PCV- 2存在一定基因差异 ,它们可能来源于不同国家或地区     

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒（CPV）的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755 bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%~100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%~100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%~99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

新民猪RYR1和MC4R基因的多态性检测分析

为了调查兰尼定1型受体(RYR1)基因和黑素皮质素受体4(MC4R)基因[其目前公认的数量性状基因座(QTN)]在新组建的民猪群体内的分布情况,试验采用PCR-RFLP的方法,对黑龙江省农业科学院畜牧研究所收集整理的23头民猪的RYR1基因和MC4R基因进行检测,并与其他已报道的猪种进行比较。结果表明:RYR1基因的N等位基因频率为86.96%,n等位基因频率为13.04%;MC4R的A等位基因频率为76.19%,G等位基因频率为23.81%,与其他猪种相比,n等位基因频率偏高。     

2016-2019年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株vlhA基因遗传进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染的最新流行情况,本研究于2016―2019年从江苏、安徽、山东、河南、河北、宁夏、黑龙江、湖北等8个省份疑似发生MS感染的鸡场采集样品,进行MS菌株的分离鉴定,结果共获得48株MS分离株。对这些分离株的vlhA基因片段测序和分析显示,其中46株均属于K基因型,另外2株分别属于A基因型和E基因型。研究结果表明,当前国内流行的MS优势基因型是K基因型,与其他国家和地区流行的基因型存在显著性差异。本研究结果为制定适合我国鸡群MS控制与净化的策略提供了必要的流行病学依据。     

2013~2017年江西省猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为掌握江西地区猪圆环病毒2型（PCV2）的分子流行病学及其遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2017年采集自江西省南昌市、宜春市、新余市、赣州市、吉安市、九江市、上饶市、抚州市、景德镇市、鹰潭市等10个地区的1 082份疑似PCV2感染猪病料组织进行病原学检测,并通过PCR扩增、克隆和基因测序对PCV2的全基因组序列进行分析。研究表明,1 082份病料中有610份为PCV2阳性,总阳性率为56.4%,其中2013~2017年阳性率分别为52.7%、48.8%、58.5%、71.0%和67.4%。共获得89株PCV2全基因组序列,其中有83株为PCV2b基因型,其中53株归类于PCV2b-1C基因亚群,30株归为PCV2b-1A/1B基因亚群;6株为PCV2a型。测序毒株与参考毒株ORF2基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.9%~100.0%和86.0%~100.0%;氨基酸序列分析表明,Cap蛋白存在20个氨基酸突变位点。本研究表明,江西地区猪群中PCV2的主导基因型为PCV2b,其中又以PCV2b-1C基因亚群占据主导地位,同时也存在少量PCV2a基因型。     

柔嫩艾美耳球虫野外抗药性虫株的RAPD分析

用RAPD方法对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的8个分别来源于黑龙江、北京、四川、甘肃和广东的中山、新会、东莞以及广州近郊的江村镇的野外分离虫株和2个药物敏感性虫株进行了遗传多态性分析。同时用9种抗球虫药物即马杜霉素（5mg/kg）、盐霉素（60mg/kg）、莫能霉素（120mg/kg）、拉沙菌素（90mg/kg）、克球多（150mg/kg）、常山酮（3mg/kg）、氯氢苯乙氰（1mg/kg）、尼卡巴嗪（125mg/kg）和球痢灵（125mg/kg）分别对8个野不进行抗药性试验，8个虫株对上述药物均有不同程度的抗药性。RAPD分析表明：10个样品都有相似而清晰的主带，每个泳道有5－13条带不等，大小为0.18-2.10kb。它们之间的相似率（SI）大于40.58%，最大的为90.72%，这种相似率属种内变异水平。根据SI值可把10个样品划分为3个类群：广东虫株类群，群内比较，平均SI值为76.60%；广东省外虫株类群，群内比较的平均SI值72.14%；敏感株类群，其间的SI值为89.27%。在另一方面，广东株与广东省外株、敏感株之间比较，其SI的平均值分别仅为63.03%和47.25%，说明柔嫩艾美耳球虫抗药性虫株之间有遗传差异法。     

传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

从中国广东省发生传染性法氏囊病的鸡场分离了8株传染性囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,运用RT-PCR对分离毒株进行了鉴定,测定了8个分离株的ELD50以及其对SPF鸡的致死率。结果表明:这8株分离毒对SPF鸡的致死率均等于或超过60%,属于超强毒。运用RT-PCR方法对分离毒株进行了鉴定并对各毒株VP2基因高变区进行扩增测序,分析结果表明:这8株分离株均为IBDV超强毒株,同时也说明当前在广东省引起鸡传染性法氏囊病的主要毒株类型多为超强毒IBDV。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。