禽白血病病毒分离鉴定

使用 SPF鸡胚成纤维细胞从蛋用种鸡的病料中分离到一株病毒.经禽白血病病毒（ALV） p-27抗原ELISA检测、病毒培养、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定、群特异性抗血清中和试验和动物回归试验等证明,该株病毒属于禽白血病病毒.     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

禽呼肠孤病毒与禽白血病病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列,设计2对引物,在建立鉴别各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立2种病毒的双重RT-PCR。对同一样品中的ARV、ALV核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增ARV 485 bp、ALV 673 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的ARV模板。用31份临床病料对本研究双重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这2种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定及其env基因序列分析

某寿光鸡群发生肿瘤病例,从瘦小的鸡中随机抽取10只鸡接种鸡胚成纤维细胞进行针对禽白血病毒（ALV）、禽网状内皮组织增生病毒（REV）和鸡马立克氏病毒（MDV）等三种肿瘤病毒的分离和鉴定,结果显示ALV和REV均为阴性,但分离到3株REV（SD1301、SD1302和SD1303）。对3株REV的env基因进行了扩增、克隆和序列分析,结果显示3株REV之间的env基因核酸同源性为100％,与国内参考毒株比较显示,3株REV分离自中国黑龙江的HLJR0901缘关系最近。本研究显示了地方品系鸡中REV感染的存在,表明要加强对我国地方品系中REV的检测和净化。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

J亚型禽白血病病毒的分离与鉴定

本研究分别从广西的地方肉鸡及河北、辽宁的蛋鸡中分离到了3株禽白血病病毒.剖检疑似发病鸡只.采集病变的肝脏、脾脏组织,经过RT-PCR检测确定为ALV感染.将病变组织接种CEF细胞,连续传代2次,将细胞上清接种DF-1细胞,p27抗原检测为阳性.同时提取病毒基因组,用H5/ADI和H5/H7两对特异性引物进行PCR扩增,结果3株为ALV-J亚型.进一步设计ALV-J亚型gp85特异性引物进行PCR扩增并测序.结果确认分离到的3株病毒为ALV-J亚型.其gp85序列与标准毒株HPRS-103同源性为96%.同时,用p27单抗进行间接免疫荧光试验,测定毒力.综上所述,我们从广西地方肉鸡巾分离到1株J亚型禽白血病病毒,从河北及辽宁的蛋鸡中分离到2株J亚型禽白血病病毒.     

浅谈禽白血病的检测方法

禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的一种传染性肿瘤病.ALV在鸡群中的存在分为A、B、C、D、J、E等多种亚型.近10年所报道的分离的ALV毒株大部分为J亚群,少部分为A、B亚群.目前国内外已经建立了很多ALV的检测方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交(ISH)、荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)等.本文就目前国内外禽白血病的检测中较常用的一些方法做一简述.     

REV和ALV-J共感染鸡病毒血症及抗体反应的相互影响

为了研究禽网状内皮增生病痛毒（REV）、禽J亚群白血病病毒（ALV—J）共感染时对彼此病毒血症及抗体反应的影响，2日龄SPF鸡分别接种REV、ALV—J或同时2种病毒造成共感染，对各感染组7周内的病毒血症及抗体反应进行动态检测。相对于单一感染，共感染时，2种病毒的病毒血症水平动态均无明显变化。在单独感染ALV—J后5周有30％（5／16）的鸡产生抗体，而有REV共感染时，没有鸡产生针对ALV—J的抗体（o／16），表明REV感染可明显抑制鸡体对ALV—J抗体的反应，而REV与ALV—J共感染对REV抗体反应无明显影响。     

禽白血病病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立及初步应用

以大肠杆菌表达、纯化的禽白血病病毒（ALV）重组P27蛋白为包被抗原,建立了检测ALV-P27抗体的间接ELISA方法,为禽白血病流行病学调查提供了一种简便的血清学检测方法.该方法与9种禽常见传染病病毒阳性血清及大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于10％,具有良好的重复性;新建立的ELISA方法比IDEXX公司生产的ALVA、B亚群抗体检测试剂盒和J亚群抗体检测试剂盒相对于免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率.     

禽白血病抗原快速检测试纸条的研制及初步应用

禽白血病给养鸡业带来极大损失,目前检测该病病原的方法主要有ELISA、PCR及RT-PCR、原位杂交(ISH)、间接免疫荧光(IFA)等。本研究应用2株抗禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体5D3和4F12研制了ALV快速检测试纸条。结果证明该试纸条具有良好的特异性,与H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、小鹅瘟病毒、鸡贫血病病毒没有交叉反应;采用p27表达蛋白检测试纸条灵敏性,检测下限达到70ng/mL;应用该试纸条检测71份临床样品,与商业ELISA试剂盒检测结果比较,二者符合率达到93%。该试纸条的研制,为基层快速检测ALV提供了条件。     

禽网状内皮组织增生症病毒单抗制备及在外源病毒检测中的应用

为了建立外源病毒检验用间接免疫荧光染色方法,本研究将禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白gp90(SU)的基因合成后连接至原核表达载体中进行表达,获得REV-SU蛋白,通过Ni柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术获得1株分泌特异性抗REV SU蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系(2A2株),该细胞株制备的腹水与不同REV毒株具有良好的反应性,荧光效价可达1：51200,与不同ALV毒株和其他常见禽的病原均没有交叉反应,特异性良好。采用该细胞株分泌的单克隆抗体建立的间接免疫荧光染色法能检出至少5个TCID50REV病毒感染量,与多克隆抗体作为检测一抗具有同等的效力,且检测背景更加纯净,适用于外源性REV病毒检验。     

Seroprevalence of avian influenza virus, infectious bronchitis virus, reovirus, avian pneumovirus, infectious laryngotracheitis virus, and avian leukosis virus in Nigerian poultry

Eight poultry farms in Nigeria, including chickens from nine breeder, 14 broiler, 28 pullet, 11 layer, and three cockerel flocks, were tested for antibody seroprevalence to the following poultry viruses of potential economic importance: infectious bronchitis virus (IBV), avian reovirus, avian pneumovirus (APV), infectious laryngotracheitis virus (ILTV), avian influenza virus (AIV), and avian leukosis virus (ALV). Serum samples were collected between 1999 and 2004 and were tested for antibodies using commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. Seroprevalence was very high for IBV (84%); intermediate for reovirus (41%), APV (40%), and ILTV (20%); and very low for ALV (<5%) antibodies. By commercial ELISA, the seroprevalence of antibodies against AIV was, in some flocks, up to 63%. However, more specific assays did not confirm AIV antibodies, indicating that all flocks tested were free of avian influenza antibodies. Birds seemed to be first infected by IBV (at about 7 wk of age), then by reovirus at 12 wk, before they became infected by APV (week 25) and ILTV (week 30). This is the first report of serological evidence of the above viruses in West Africa. Further studies are necessary to assess economic losses due to these avian viruses and the costs and benefits of countermeasures.     

RT-PCR快速诊断禽流感

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果,设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物,不经病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸, ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株,４个亚型１２株国内分离野毒株,ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性;对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒,ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和 Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品 ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２; ２４／５５、２４／５５, 二者符合率大于９５％。 ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测,只用６个小时就可得出准确的诊断结果,证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异,可用于禽流感的快速诊断。     

SYBR Green I荧光 RT-PCR方法检测禽流感病毒

为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测,试图建立快速检测AIV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,并与普通RT-PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明:此次建立的检测AIV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72 h的AIV,对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5.33%(9/169),而普通RT-PCR方法检出率为6.51%(11/169),病毒滴定检出率为5.62(9/160)。对其他病毒(NDVI、BDVI、BV、VA)则未检测到,且整个检测过程只需4 h,表明该方法特异、准确、快速。     

J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。