犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析

为了解上海地区犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）遗传变异情况，本研究采用首尾重叠的11对特异性引物，对CDV上海株SH202003进行RT-PCR扩增，将扩增片段进行反复测序，序列拼接后最终获得了SH202003株全基因组序列，应用Lasergene 7.0和Mega 6.0软件对全基因及H基因进行序列分析，并构建系统进化树。结果显示，SH202003株基因组全长为15 690 bp，编码6种结构蛋白（N、P、M、F、H和L），H和L基因间隔序列为CUA，L和5'端尾随序列为CAA，与Hebei株核苷酸和氨基酸相似性最高，达到98.6%和96.6%，与疫苗株核苷酸相似性在92.2%~94.3%，氨基酸相似性只有82.7%~87.0%；全基因进化树中，SH202003株与流行野毒株在同一分支，与疫苗株在不同的分支；H基因同样与Hebei株亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%和99.5%，与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac及Onderstepoort亲缘关系较远；SH202003株处于Asia-1型分支，属于Asia-1型强毒株；SH202003株具有9个潜在N-糖基化位点，与强毒株Hebei株一致。研究表明，上海株SH202003属于CDV强毒株，为Asia-1型，其H基因序列相对保守，具有9个潜在N-糖基化位点，但是全基因序列存在较多突变，与疫苗株的匹配度较差，可能是免疫犬依然发生犬瘟热的主要原因。     

桑树光合系统Ⅰ psaE基因的克隆及表达分析

利用桑树(MorusL.)表达序列标签(EST),采用RT-PCR方法克隆了桑树光合系统Ⅰ(PSⅠ)psaE基因的全长cDNA序列,命名为MpsaE(GenBank登录号:GU645972)。序列分析表明,该基因序列全长705bp,存在97bp的5′端非翻译区和170bp的3′端非翻译区,其开放阅读框(ORF)长438bp,编码含有146个氨基酸的蛋白,预测蛋白分子质量为15.38kD,等电点为8.08。同源性分析表明,MpsaE编码蛋白与柑桔(Citrus sinensis)、毛果杨甙(Populus trichocarpa)和欧美杨(Populus eu-ramericana)psaE基因编码的蛋白具有较高的同源性,相似性达到98%。基于MpsaE与其它18个物种的psaE基因编码氨基酸序列构建的系统进化树显示,桑树与柑桔、蓖麻(Ricinus)、毛果杨甙和欧美杨的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MpsaE基因mRNA在桑树不同组织及部位的转录水平有明显差异:在叶片中的转录水平较高,其中幼叶(刚展开的第1片叶)和中部叶片(8-10位叶)的转录水平最高,其次为上部叶片(2-3位叶)、顶芽和下部叶片;在根部的转录水平最低。初步推测MpsaE基因是桑树PSⅠ参与某些光合生理反应的一个亚基。     

南阳牛BoLA-DRA基因编码区生物信息学分析

[目的]预测南阳牛BoLA-DRA编码蛋白区的理化性质和结构特征.[方法]运用生物信息学分析软件.[结果]DRA基因与其它物种核苷酸序列的同源性均在90％以上.进化树分析羊与牛在同一个分支上,亲缘关系最近.BoLA-DRA编码蛋白为疏水性蛋白,1个跨膜螺旋的膜蛋白,7个功能结构域,6个翻译后修饰位点.预测N末端包含信号肽序列,其切割位点位于26～27位的氨基酸之间.亚细胞定位该蛋白定位在细胞膜上,由α螺旋结构,β折叠结构、β转角结构和无规则卷曲结构形成二级结构.[结论]本试验初步获得了BoLA-DRA编码蛋白区生物信息学分析数据.     

紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因的表达及抗逆性分析

根据NCBI中紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(MET1, 登录号:AF189766.1)cDNA序列设计一对特异性引物,以紫花苜蓿品种“农菁1号”的cDNA为模板,利用PCR技术克隆出的一个基因,命名为MsMT1,测序发现该基因全长228 bp,编码75个氨基酸。通过碱基序列比对发现MsMT1与MET1的相似度为99%。通过氨基酸序列分析和进化树分析,发现与其他植物的1型金属硫蛋白基因具有较高的同源性。利用qRT-PCR对MsMT1在苜蓿不同器官中的表达进行分析,发现该基因在根和子叶中表达量较高。将苜蓿幼苗进行不同浓度NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃及不同pH值胁迫处理后, 观察MsMT1基因的表达,发现MsMT1的表达量随盐碱处理液浓度和pH值变化发生改变,说明MsMT1与植物的抗逆性相关。采用农杆菌介导法将MsMT1导入苜蓿植株体内,卡那抗性的筛选和Northern blot结果显示MsMT1基因能够在转基因苜蓿中高效表达。用不同浓度NaCl、NaHCO₃处理野生型和转化MsMT1基因的苜蓿幼苗,观察幼苗受胁迫后的表型,发现转基因的苜蓿幼苗比未转基因的苜蓿幼苗抵抗力高。本研究表明MsMT1基因能够增加苜蓿对胁迫的抗性。     

沙棘-桑树人工混交林对铁尾矿土壤的改良效益分析

通过测定与调查铁尾矿区营建沙棘-桑树人工混交林的土壤理化性质、养分含量及分布,评价人工混交林对铁尾矿区土壤改良的作用。与新尾矿区土壤相比,沙棘-桑树混交林下尾矿土壤容重与毛管孔隙度分别减小5.85%、5.04个百分点,空气孔隙度和自然含水量分别增加了10.97、1.35个百分点,混交林下尾矿土壤0～40 cm土层的平均相对含水量比新尾矿土壤增加12.90个百分点,表明混交林植物根系的生长促使原来致密的尾矿砂土的物理性质得到有效改善。混交林对尾矿碱性土壤的改良作用明显,且桑树的改良作用优于沙棘。混交林下尾矿土壤中的有机质含量增加,为对照新尾矿土壤的7.22倍,有机质含量随土层加深而递减,且均有一定的表聚性,主要分布在0～20 cm土层;但混交林下尾矿土壤中的有机质含量仍然较低,仅是该区域对照山地天然灌丛土壤的17.15%。混交林下尾矿土壤速效态大量元素的含量依次为速效P>速效K>碱解N,全量为K>P>N,其中沙棘根系周围土壤中的全N、全P、全K含量高于桑树,而桑树根系周围土壤中的全Ca和全Mg平均含量略高于沙棘。依据上述结果认为,沙棘-桑树人工混交林可有效改良铁尾矿土壤的理化性质,增加土壤养分含量。     

铁尾矿区沙棘-桑树人工混交林的养分分配状况

为了评估铁尾矿区废弃地的植被恢复中,利用沙棘-桑树人工混交林提高林地养分总体水平的可行性,测定混交林中沙棘、桑树和草本植物的地上部分、根系及枯枝落叶中的N、P、K、Ca、Mg含量与贮量,测定沙棘、桑树根系周围土壤中的养分含量。结果表明:沙棘的根、干、枝、叶、皮中的N含量明显高于桑树,尤其是不同土层根系中的N含量可达到桑树根系的3.03～4.33倍,沙棘根系中的Ca、Mg含量高于桑树,P含量与桑树相近,而桑树地上部分的P、K、Ca、Mg含量以及各土层根系中的K含量大多高于沙棘;沙棘根系周围土壤中的全N含量高于桑树根系周围土壤,其平均含量为桑树的1.88倍,根系周围表层0～20 cm土壤的全N含量为桑树的3.18倍;混交林中乔木、草本、枯落物的总养分贮量大小为:沙棘>枯枝落叶>桑树>草本植物,其中沙棘的养分贮量占混交林系统养分总贮量的56.10%。研究结果提示:沙棘在整个混交林系统的养分分配中起到支配性作用,可为桑树的正常生长发育提供良好的养分空间,沙棘-桑树混交林是生态效益与经济效益双赢的混交模式。     

洋草麦HdCAD基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆洋草麦肉桂醇脱氢酶基因（HdCAD）,揭示HdCAD基因的序列特性,对HdCAD蛋白进行生物信息学分析。[方法]以洋草麦转录组数据中的HdCAD为参考序列,设计1对特异引物,利用RT-PCR技术克隆HdCAD基因;利用生物信息学软件对HdCAD基因序列进行分析,对HdCAD蛋白的理化性质、蛋白结构、亚细胞定位等进行预测和系统进化树分析。[结果]HdCAD基因编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸。HdCAD蛋白含有17个磷酸化位点,不含有跨膜结构域和信号肽位点,预测定位在细胞质中;二级结构中,以无规卷曲元件占比最高;含有1个典型的CAD1结构域,属于MDR超家族。系统进化树分析结果显示,HdCAD蛋白与二粒小麦、节节麦、西藏裸大麦亲缘关系最近。[结论]该试验成功克隆HdCAD基因、预测了该基因编码蛋白的序列特征和功能,可以为今后研究洋草麦抗非生物胁迫功能提供参考。     

贵州地区桑属(Morus L.)植物的分布及区系特点

依据贵州省植物标本馆(HGAS)桑属植物标本及相关文献资料,对贵州地区桑属(MorusL.)植物分布及区系特点进行了分析。该地区桑属植物的9个桑种主要分布在海拔240~2 400 m的黔东北、黔东南、黔西南,其中:白桑(M.albaL.)分布广,分布地区海拔在1 000 m以下;长穗桑(M.wittiorum Hand-Mazz.)属孑遗分布,分布于沟谷且冬无严寒处;长果桑(M.laevigata Wall.)与长穗桑为同一种系,分布同域,数量少,且有分化;鸡桑(M.australisPoir.)在高海拔寒湿区域形成群落,类型丰富,且仍在分化;蒙桑(M.mongolicaSchneid.)及变种鬼桑(M.mongolica Schneid.var.diabolica Koidz.)抗旱耐寒,分布少,被滇桑[M.yunnanensis(Koidz.)C.Y.Wu et Cao.]替代;华桑(M.cathayana Hemsl.)和山桑(M.bombycis Koidz.)的分布也少,山桑可分布于较高海拔;裂叶桑[M.trilobata(S.S.Chang)Cao.]新拟,仅在低海拔的凯里地区有分布。该地区桑属植物分布的区系特点是:种类丰富,多型性突出,起源古老,特有现象明显,与邻近省份桑属植物分布区系联系密切。认为该地区是研究桑属植物起源与演化的关键地区之一。     

Comparative analysis of the lppA locus in Mycoplasma capricolum subsp. capricolum and Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae.

The lppA gene, encoding the lipoprotein named LppA[Mcaca] was characterised in Mycoplasma capricolum subsp. capricolum. It encodes a lipoprotein with an apparent molecular mass of 57 kDa as determined by SDS-PAGE. Using antibodies directed against recombinant LppA[Mcaca], we showed the expression of this lipoprotein in all M. capricolum subsp. capricolum by immunoblot analysis. The serum did not cross-react with other members of the Mycoplasma mycoides cluster, hence showing that LppA[Mcaca] was antigenically specific to M. capricolum subsp. capricolum. The lppA gene was conserved within the subspecies and was used for the development of a specific PCR assay for the identification of M. capricolum subsp. capricolum. The taxonomically related Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae (F38) was found to contain an lppA-pseudo-gene. It showed high similarity to functional lppA genes of other mycoplasmas in the M. mycoides cluster. However, it contained interrupted open reading frames. Moreover, the nucleotide sequence of the lppA pseudo-genes in different strains of M. capricolum subsp. capripneumoniae were quite variable. Interestingly, the lppA pseudo-gene had a size similar to that of the functional lppA genes of other mycoplasmas of the M. mycoides cluster and occupied the same genomic location as the latter ones in the vicinity of the mtlD genes. This study showed that all members of the M. mycoides cluster contain each a species-, subspecies- respectively type- specific lppA gene analogue which encodes a lipoprotein that has structural and functional relationship to the surface lipoprotein LppA [MmymySC], previously named P72, of M. mycoides subsp mycoides SC, with the exception of M. capricolum subsp. capripneumoniae which seems not to express an LppA analogue.     

98份不同桑树品种资源的桑叶总生物碱及1-脱氧野尻霉素含量测定

为了筛选适合药食用途开发的桑树品种,以广东桑、鲁桑、白桑和鸡桑4个桑种的98份桑树品种资源为材料,分别采用雷氏盐比色法和柱前荧光衍生-高效液相色谱法,对各品种资源的桑叶总生物碱含量和1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量进行测定。98份桑树品种资源桑叶中的总生物碱和DNJ含量从总体上符合正态分布,4个桑种间以及多倍体和二倍体桑树品种间没有显著差异,而不同品种资源间差异明显,其中白桑种的育7803的桑叶中的总生物碱和DNJ含量最高,分别为3.74、1.54mg/g,桑叶中的总生物碱质量比>3.00 mg/g的还有广东桑种的抗锈3,DNJ质量比>1.00 mg/g的还有广东桑种的黑皮桑、抗锈2和白桑种的阿2。这些桑树品种资源适合用于桑叶的药食用途专用品种的培育。     

广灵驴FTO基因克隆、序列分析及组织差异表达

[目的] 对广灵驴脂肪和肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated gene,FTO）进行克隆及序列分析,同时检测其在广灵驴各组织中的表达差异,以探究广灵驴FTO基因结构对其生理代谢功能的影响。[方法] 运用RT-PCR技术扩增并克隆广灵驴FTO基因CDS序列,进行基因及蛋白质功能分析,同时运用实时荧光定量PCR方法检测FTO基因在广灵驴7种组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌及皮下脂肪）中的差异表达。[结果] 广灵驴FTO基因CDS区序列长1 518 bp,编码505个氨基酸,序列提交至NCBI,登录号：MZ169553。广灵驴FTO基因与马、猪、牛、人、羊驼、绵羊和山羊的相似性为99.3%、90.3%、89.5%、90.8%、90.7%、89.2%和89.2%;系统进化树分析发现,广灵驴与马的亲缘关系最近。FTO蛋白分子质量为58.35 ku,理论等电点为5.07,脂肪系数为80.36,不稳定系数为48.82,平均疏水指数为-0.550,为不稳定的酸性亲水蛋白。FTO蛋白无信号肽和跨膜区,主要定位于细胞质中,具有34个磷酸化位点与5个糖基化位点。FTO蛋白二级结构主要以α-螺旋（43.96%）和无规则卷曲（37.82%）为主。实时荧光定量PCR分析发现,FTO基因在广灵驴7个组织中均有表达,其中在肺脏和皮下脂肪中的表达量极显著高于其他组织（P<0.01）,在背最长肌中表达量最低。[结论] 本试验结果可为下一步基因表达与调控脂肪沉积机制及改善驴肉品质的研究奠定基础。     

狂犬病口服疫苗SRV9毒株基因序列的生物信息学分析

为了解狂犬病口服疫苗SRV₉毒株的基因序列与生物学特性的关系,并就其主要抗原位点与国内外现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,明确其作为口服疫苗株的分子基础,本试验通过RT-PCR方法对狂犬病口服疫苗SRV₉毒株的N、P、M、G、L基因分别进行克隆,并分别连接于pMD19-T载体,经酶切、测序鉴定后,用DNAStar软件对全基因序列进行分析,并与11株目前生产用狂犬病疫苗株进行基因序列比对分析和主要抗原位点的比较.狂犬病口服疫苗SRV₉毒株N、P、M、G、L基因序列与其他毒株的序列同源性为81.8%~100.0%,由全基因组进化树可知,SRV₉毒株与所有疫苗株在同一个大的分支内,均属于基因Ⅰ型,其中狂犬病口服疫苗SRV₉毒株与ERA、SAD B19、SAG-2等口服疫苗株的进化距离最近,而与疫苗生产毒株aG、RC-HL 之间的进化距离则较远.狂犬病口服疫苗SRV₉毒株与各疫苗株的糖蛋白不同结构区的氨基酸同源性分析表明,狂犬病口服疫苗SRV₉毒株与SAD B19、SAG-2、ERA口服疫苗株的膜外区、跨膜区和膜内区的同源性最高.狂犬病口服疫苗SRV₉毒株的基因组结构和抗原基因位点特征均与目前生产用口服疫苗株相似,这为今后狂犬病口服疫苗的研制和通过分子生物学技术构建基因重组弱毒疫苗株的研究提供了试验依据.     

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。     

红嘴鸥TLR7基因克隆与生物信息学分析

[目的] 克隆野生鸟类红嘴鸥Toll样受体7（TLR7）基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析,为后期TLR7蛋白的抗病毒活性研究做准备。[方法] 采用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）扩增红嘴鸥TLR7基因全序列,通过生物信息学软件分析TLR7基因序列、稀有密码子、相似性及其编码蛋白的理化性质、跨膜区域、信号肽、N-糖基化位点、磷酸化位点和亚细胞定位,分别利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测TLR7蛋白的二级结构和三级结构。[结果] 试验成功克隆红嘴鸥TLR7基因（GenBank登录号：MZ668652）,全长1 720 bp,开放阅读框（ORF）大小为1 182 bp,存在39个稀有密码子,其中含8个连续稀有密码子,编码393个氨基酸;红嘴鸥TLR7基因与GenBank中原鸡、红腹角雉、鹌鹑、绿头鸭、黑天鹅、山雀、白鹭、帝企鹅、红喉潜鸟和巴布亚企鹅的TLR7基因相似性分别为85.7%、84.9%、85.4%、87.0%、87.8%、86.8%、91.0%、93.1%、93.1%和93.1%。系统进化树结果显示,其与白鹭的亲缘关系最近。TLR7蛋白分子式为C₂₀₈₀H₃₂₅₆N₅₅₆O₅₆₇S₁₉,分子质量约为63 ku,理论等电点为9.25;该蛋白不存在跨膜结构和信号肽,含有6个N-糖基化位点和33个磷酸化位点,是疏水性蛋白,主要存在于细胞质中;TLR7蛋白二级结构主要以α-螺旋为主,约占48.09%,其次为无规则卷曲（32.06%）、延伸链（13.23%）和β-转角（6.62%）,TLR7蛋白的三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TLR7蛋白相似性为68.78%。[结论] 红嘴鸥TLR7基因与白鹭进化关系较近,含有8个连续稀有密码子,体外表达较难,研究为进一步探索红嘴鸥TLR7蛋白抗病毒免疫机制提供重要参考。     

牛二酰甘油转酰基酶(DGAT1)基因的生物信息学分析

DGAT1基因作为影响奶牛产奶和肉牛肉质性状的主效基因之一,引起了人们越来越多的关注。本文应用生物信息学方法比较了人、牛、猪、绵羊等24个物种的DGAT1基因编码区(CDS)核苷酸和蛋白质序列,并对该基因的遗传多样性进行了分析。结果表明,DGAT1基因的CDS核苷酸和蛋白质序列长度多样性丰富;具有终止密码子偏爱性,包括牛在内的所有脊椎动物终止密码子都为TGA;在长度为1 187bp的33条基因序列中检测到992个多态位点,共生成26种单倍型。从聚类分析图可以看出,脊椎动物、无脊椎动物、植物和微生物的DGAT1基因之间存在着进化分歧,但界内差异较小。     

大片吸虫组织蛋白酶L全长序列的获取及其生物信息学分析

根据文库载体序列与原组织蛋白酶表达序列标签（EST）设计引物,以大片吸虫cDNA文库为模板,进行Touchdown PCR与梯度PCR相结合的扩增反应,扩增产物克隆人pMD18-T载体。经鉴定后测序,并采用生物信息学技术对序列进行开放阅读框（ORF）、编码氨基酸序列、蛋白质同源性比较、二级、三级结构等分析;结果所获序列全长990bp,编码330个氨基酸,分子量36771.2u,等电点5．44;具有较明显的螺旋、片层和无规卷曲等二级结构,α螺旋占17．3％,β折叠占27．0％,无规卷曲占55．8％;具有2个较明显的跨膜区和2个疏水区,未发现明显的信号肽和糖基化位点;氨基酸序列同源性比对显示其属于半胱氨酸家族;三级结构同源建模预测显示其与组织蛋白酶K（PDB number 2f7dA）有49％的一致性。     

新城疫F_(48)E_9株L基因克隆与鉴定

本实验根据已知新城疫病毒L基因序列分别设计了两对引物 ,引物 1(L1)、引物 2 (L2 )、引物 3(L3)、引物 4(L4)。以L1/L2为引物可以扩出 40 5 0bpF4 8E9株L基因的A片段 (LA) ,以L3/L4为引物可扩增出 35 0 4bpF4 8E9株L基因的B片段 (LB)。LA和LB 2个片段经特异性双酶切后用T4DNA连接酶连接成完整的F4 8E9株L基因并克隆到pMD18_T载体中 ,对克隆后L基因 5’端、3’端和连接点处的核苷酸序列进行了测定 ,经DNASIS软件分析表明为NDVL基因 ,证明我们获得了F4 8E9株L基因     

鸭茅叶绿体引物筛选

为筛选适用于鸭茅物种的基因引物序列,开展相关系统发育学研究,通过搜集鸭茅近缘物种叶绿体基因引物,使用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选出目的基因片段,对目的基因进行BLAST序列比对.结果表明:试验搜集的35对引物中共能筛选出trnL-F 1、trnL-F 5、rpL162、rpL164、matK 6、matK ...     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。