基于同源重组的产绿色荧光蚕丝转基因家蚕的制备

采用基因打靶技术对家蚕丝素蛋白基因(fib)进行分子设计与遗传改造,探讨从基因水平改良蚕丝性能的可行性。以家蚕丝素轻链基因(fib-L)终止密码子TAA上游1.2 kb(fib-LL)和下游0.5 kb(fib-LR)片段作为基因打靶载体的左右同源臂,将绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到两同源臂的中间,并使其与fib-L基因处于同一读码框,构建基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。将该载体质粒转染BmN细胞后,荧光显微镜下观察细胞呈现绿色荧光,表明载体构建成功。将该载体质粒通过精子介导法导入家蚕品种高白的卵,在G0代筛选出茧呈绿色荧光的家蚕,并通过PCR检测证实其为转基因家蚕;用GFP抗体对G3代转基因家蚕幼虫后部丝腺组织进行Western blotting检测,有分子质量为65 kD的Fib-L-GFP融合蛋白特异性条带呈现。转基因家蚕所产蚕丝在蓝光的激发下发出绿色荧光,表明通过基因打靶将gfp导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。     

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

鸡卵清蛋白基因启动子克隆及其活性的检测

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。     

家蚕转基因研究及肌动蛋白A3启动子的表达分析

通过显微注射法,将转基因载体pBcA3EG及辅助质粒pA3H导入产后1h的蚕卵,在G1代获得家蚕转基因的阳性个体.通过对G2代转基因蚕基因组的Southern杂交分析表明,获得的该转基因品系为EGFP基因的单拷贝插入.同时对G2代个体不同发育时期及不同组织进行荧光观察,发现EGFP在转基因家蚕幼虫期的表达较其它时期强,而幼虫时期强烈的EGFP主要由中肠组织的杯形细胞高量表达所致.这些结果初步表明A3启动子在家蚕的不同发育时期及不同组织存在表达的活性差异.     

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。     

表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状

为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

重组山羊痘病毒通用转移载体的构建

为了便于山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)活载体疫苗的研究,本试验拟构建能够用于GPV重组的通用转移载体。用DNA合成和PCR方法构建含有启动子p7.5和p11的质粒pTKpp,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒pTKpp-GFP和通用转移质粒pTKpgigp,转染已感染GPV的羔羊睾丸(lamb testis,LT)细胞,观察GFP的表达情况;同时在pTKpgigp中插入外源基因FMDVVP1,构建重组转移质粒pTKpgigp-VP1,与GPV共转染LT细胞,产生并筛选重组GPV,验证外源基因的表达情况。结果显示,重组质粒中的启动子p7.5和p11能够启动GFP的表达;以重组转移质粒pTKpgigp-VP1进行的GPV重组成功获得了rGPV。最终证明通用转移载体pTKpgigp构建成功,能够用于重组GPV的相关研究。     

绿色荧光蛋白基因在家蚕的表达研究

将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入家蚕蛹(G_0)的睾丸,利用荧光显微镜技术检测到绿色荧光蛋白基因在家蚕卵(G_1)表达的荧光图像。     

团头鲂β-actin启动子在家蚕中活性分析

利用双式荧光报告基因检测团头鲂β-actin启动子在家蚕BmN细胞和在家蚕体内的活性。通过脂质体介导法将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)混合均匀后转染BmN细胞,48h后,可以检测到同时发绿色荧光和红色荧光的家蚕细胞,表明来自团头鲂的β-actin启动子在家蚕BmN细胞具有活性,能驱动DsRed基因在家蚕BmN细胞中表达。以gfp、dsred的特异引物,可从pigA3GFPAβdsRed转化家蚕BmN细胞基因组内扩增出gfp、dsred相应大小的片段,提示外源基因已经插入到细胞基因组中。随着转化细胞的传代,绿色荧光稳定存在,而红色荧光会逐渐减弱直至检测不到,暗示β-actin启动子在家蚕细胞中容易受到家蚕BmN细胞因子的影响而活性减弱。将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)利用精子介导法导入家蚕受精卵,7天后,在部分受精卵中可观察到绿色荧光和红色荧光,进一步证明了β-actin启动子在家蚕体内具有活性。结果显示,含双式荧光报告基因的转基因载体为鉴定β-actin启动子等外源启动子在家蚕中的活性提供了快捷准确的鉴定方法。     

三眠蚕诱导剂SM-1对家蚕丝蛋白合成调控机理的研究——Ⅱ.SM-1对后部丝腺DNA合成速率和核酸含量的影响

本文探讨三眼蚕诱导剂SM一1对家蚕丝蛋白合成的调控机理.试验结果表明:(1)sM-1处理后,家蚕后部丝腺DNA中~3H-胸腺嘧啶核苷的参入速率明显增快.SM一1诱导三眠蚕在四龄第2天~3H-胸腺嘧啶核苷的参入量最高,比同时的对照高近1倍;五龄第2天SM—1处理区,在五龄第3天~H-胸腺嘧啶核苷的参入速率有所增快.(2)SM-1诱导的三眠蚕,后丝腺DNA和RNA含量的高峰比对照提前4-6天出现,且其末龄(四龄)DNA和RNA含量的增减趋势与对照末龄(五龄)DNV和RNA含量的增减趋势非常相似.(3)五龄前期用SM一1处理家蚕幼虫,对后丝腺DNA和RNA含量增加具有暂时的促进作用.     

家蚕幼虫体中黄酮类化合物的提取与测定

家蚕自古为滋补食疗珍品,丰富的有效活性成分使其具有独特的药理作用,为推进家蚕幼虫体的药用开发,用紫外分光光度法研究了家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量在不同品种间的变化规律。将家蚕幼虫干燥粉碎,选用80%乙醇为溶剂,原料体积质量按0.0333g/mL在60℃下抽提4h,重复抽提3次,可高效地提取家蚕幼虫体黄酮类化合物。以NaNO2、Al(NO3)3显色,用紫外分光光度计于510nm波长下比色,可精确、稳定地测定出家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量。结果表明,家蚕幼虫体富含黄酮类化合物,不同蚕品种其含量存在显著差异。     

家蚕精子介导转基因技术体系的优化

为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。     

克蚧威农药对家蚕的毒力及残效期研究

本文介绍了克蚧威对家蚕的毒力和残效期.结果表明:克蚧威对家蚕有很强的触杀作用,秋季对三龄蚕的触杀毒力回归方程为Y=2.458十1.862X,Lc_(50).为23.185ppm,LD_(50)为0.012ug/头,春季800倍液喷桑叶对家蚕的安全间隔期为10天.蚕对克蚧威的抗性因蚕龄大小和季节不同有异.     

A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究

构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。     

原蚕稚蚕颗粒人工饲料育的研究

调查了6个家蚕原种、2个杂交种对颗粒人工饲料的摄食性,重点探讨了4个原种1~2龄颗粒饲料育对其生长发育、产卵性能和叶卵转效率的影响。结果表明,不同蚕品种对颗粒人工饲料的摄食性存在极大差异,从24 h疏毛率来看,杂交种高于原种,日系品种高于中系品种。原蚕稚蚕颗粒人工饲料育的1~3龄发育经过比全龄桑叶育对照显著延长,但5龄期发育加快,差距缩小。小蚕颗粒人工饲料育对原蚕虫蛹生命率无明显影响,全茧量高于全龄桑叶育,但茧层率低于对照组。造卵数1~2龄颗粒饲料育略少于全龄桑叶育,但残留卵率显著降低,平均产卵量与全龄桑叶育基本相同,良卵率也无明显差异。小蚕颗粒饲料育的5龄食下量均低于全龄桑叶育,4个品种平均减少11.0%,叶卵转化率比全龄桑叶育平均提高15.6%。