蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2（MRJP2）,为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q Exactive）对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白，制备相应的多克隆抗体，根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成，随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中，获得重组杆状病毒质粒，再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示，B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应，并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白，B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠，制备小鼠多克隆抗体，经间接ELISA检测，该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。     

利用杆状病毒系统在昆虫细胞TN5中表达家蚕30K蛋白

为研究30K蛋白抑制细胞凋亡的作用,利用RT-PCR从家蚕总RNA中扩增到30KC19基因,对其进行了序列分析并克隆到杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,构建成重组转座载体pFastBacHTb-30KC19。利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞TN5中进行了表达和蛋白检测。结果表明30K蛋白在昆虫细胞中得到了高效表达。     

用pFASTBAC-THa系统表达IBV SD株S1基因

pFASTBAC表达系统是一种经过改造的昆虫杆状病毒细胞表达系统，共有3组即pFASTBAC-THa、pFASTBAC-THb、pFASTBAC-THc，可根据待插入的外源基因的特性进行选择。该表达系统除具有常用昆虫杆状病毒细胞表达系统的优点外，其最大特点是构建重组昆虫杆状病毒的全过程均在细菌中进行，使重组简单快速。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达

以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术

昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而,由于各种因素重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平。提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。根据目前的研究,提高外源基因表达水平的技术主要包括抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如用家蚕幼虫或蛹进行表达等。这些技术也为家蚕成为更加高效的生物反应器奠定了基础。     

猪圆环病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究

本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）PCV2b的ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMⅠPPH启动子控制下的多克隆位点,构建的质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-cap。将rBacmid-cap转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验证明目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后,用Western blot在细胞培养上清中检测到了目的蛋白,并于d 5达到表达高峰。电镜观察结果显示上清中的目的蛋白可以装配成直径约为17 nm的病毒样颗粒。病毒样颗粒在培养上清中的大量存在,为目的蛋白进一步的分离和纯化提供了便利,也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达和纯化

为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现...     

种植密度对科尔沁沙地饲用燕麦产量和品质的影响

通过对不同种植密度条件下燕麦株高、根、茎、叶、穗生物量测定,计算根冠比、茎叶比、根系贡献率、茎秆贡献率、叶片贡献率、穗贡献率等相关指标,探讨种植密度对沙地燕麦株高、生物量和物质分配规律的影响,为科尔沁沙地燕麦合理种植密度的确定提供参考。结果表明：燕麦株高随着种植密度增加呈现逐渐增加的变化趋势,450万株·hm^-2条件下株高最高,其值为92.06 cm;地上生物量、地下生物量和总生物量均随密度增加呈现先升高后降低的变化趋势,最高值均出现在350万株·hm^-2条件下,分别为2 277.32 g·m^-2,578.47 g·m^-2,3 022.46 g·m^-2;300万株·hm^-2条件下根冠比和茎叶比均高于其他密度条件下,其中密度处理之间茎叶比差异不显著,300万株·hm^-2条件下根冠比显著高于其它密度处理;叶片贡献率和茎秆贡献率各密度处理之间没有显著差异,300万株·hm^-2条件下根系贡献率显著高于400万株·hm^-2,根茎叶中可溶性糖、淀粉含量在350万株·hm^-2条件下达到最大值,叶片中粗脂肪、粗蛋白含量随密度增加呈逐渐降低的变化趋势,最大值分别为16.02%,5.66%。因此,综合考虑,以饲用为主要目的建议科尔沁沙地燕麦种植密度350万株·hm^-2。     

转录组学在骆驼科动物中的应用研究进展

骆驼生活在恶劣的自然环境中,拥有特殊的生物学特性。目前,骆驼的转录组(RNA-seq)水平研究较少。文章对骆驼科动物的转录组学研究方面进行了综述,揭示了骆驼在渗透调节和水分保留中涉及水重吸收和葡萄糖功能的基因网络,以及其在耐盐性、水代谢、抗癌性、被皮毛色等方面的一些机制,分析了现阶段转录组学在骆驼科动物研究中面临的问题与挑战,并对未来骆驼科动物转录组学研究趋势进行了展望,为骆驼科动物独特生物学特点的生理机制研究提供参考。     

阿拉善双峰驼阴道蝇蛆的形态结构观察

阿拉善双峰驼阴道蝇蛆病是由黑须污蝇(Wohlfahrtia magnifica)幼虫寄生而引起的一种疾病,论文对阿拉善双峰驼阴道蝇蛆形态结构进行了观察。一期幼虫为从野外捕捉的黑须污雌蝇体内获得或从双峰驼阴门附近采集雌蝇刚排出的一期幼虫;在患病驼阴道病灶处可以捕捉到二期、三期幼虫,采用扫描电子显微镜、一体式解剖显微镜、超景深成像仪等进行观察并描述。在解剖镜下看到蝇蛆具有12段体节,分别为1段双叶伪头、3段胸节、7段腹节和肛部。扫描电子显微镜下观察到一期幼虫双叶伪头上具有很多感受器和一对口钩,口钩附在头骨架上,蝇蛆体表有很多硬刺,每一体节上刺的数量与排列方式不同。黑须污蝇二期、三期幼虫前呼吸孔呈扇形,由5个分支组成。肛部为最后一体节,呈半球型,后呼吸孔隐藏在气门腔内。     

复合添加剂对肉牛生长性能和代谢参数的影响

由于复合添加剂具有控制代谢问题和提高动物生长性能的能力,最近已被用于动物饲料中。本研究评估了复合添加剂摄入量是否会改变肉牛瘤胃发酵参数或动物生长性能。试验共分为两个部分,生长试验和代谢试验,其中生长试验分为生长期(42 d)和育肥期(84 d),共48头肉牛(12个平行),而代谢试验共4种日粮。结果显示:在生长试验中,复合添加剂提高了肉牛干物质摄入量和反刍时间(P <0.05)。在育肥期中,日粮添加复合添加剂较对照组显著提高了干物质摄入量(P <0.05),各处理对瘤胃发酵指标无显著影响(P> 0.05)。综上所述,在肉牛生长期日粮中添加复合添加剂(氨基酸+维生素+有机矿物质+益生菌+必需脂肪酸)可以提高干物质摄入量和反刍时间。     

胰高血糖素样肽-2的研究进展

胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2,GLP-2)是由肠道内分泌L细胞合成分泌的、胰高血糖素原经转录、翻译后加工处理的33个氨基酸多肽。文章介绍了GLP-2的合成、代谢与生理功能,GLP-2在动物肠道内可促进肠道营养吸收、抗炎、促进肠道损伤修复,在肠道外可以通过脑-肠轴调节食物摄取、血压、胰高血糖素的分泌和骨的重吸收;对GLP-2发挥生物活性的可能作用途径cAMP/蛋白激酶途径、PI-3K/Akt途径、激活ERK1和ERK2途径、刺激生长因子的释放等途径进行阐述;并对GLP-2和GLP-2类似物在人的疾病治疗和动物生产中的应用进行概述。     

生物地毯治沙工程—生物结皮现状的研究进展

生物土壤结皮（Biological Soil Crusts,BSC_S）是荒漠地段广泛分布的地表活性覆盖物,在干旱区生态恢复过程中存在不可替代的多重生态功能。本文从干旱、半干旱地区BSC_S形成、演替和分布规律,以及其对土壤理化性质、碳氮固存、抵抗风蚀、水分入渗等多种生态功能的影响等两个方面来阐述国内外BSC_S的研究现状,总结BSC_S研究中存在的问题,探讨BSC_S研究前沿问题和未来趋势,试图在BSC_S的生态研究、监测、管理和修复方面提出新的观点和见解,这对进一步开展BSC_S相关研究具有重要意义。     

放牧对羊草根际土壤线虫群落及区系的影响

为了探索放牧干扰对羊草（Leymus chinensis Tzvel）根际土壤小型动物-土壤线虫群落的影响规律,本试验以土壤线虫为生物指标对典型草原放牧区及围栏区羊草根际土壤线虫群落特征及区系进行了研究,结果表明：羊草根际共捕获34属线虫,放牧影响羊草根际线虫总数量及优势类群,不同土层土壤线虫总数量的分布规律为：围栏区>放牧区,放牧区优势及次优势类群中植物寄生线虫类所占比例明显高于围栏区。放牧区羊草根际土壤线虫Shannon多样性指数显著高于围栏区。放牧区瓦斯乐斯卡指数及自由生活线虫成熟度指数低于围栏区,说明放牧区土壤健康状况较差。放牧影响羊草根际土壤线虫区系的分布,放牧区0~10 cm,10~20 cm羊草根际土壤线虫区系分布在B区和D区,表明放牧区土壤线虫食物网相对于围栏区受干扰大、土壤线虫食物网不稳定,且退化。     

基于RNA_Seq技术分析对乙酰氨基酚对斑马鱼转录组的影响

为了研究对乙酰氨基酚对斑马鱼发育影响,采用高通量转录组测序RNA-seq技术对对乙酰氨基酚处理组(CAPAP组)与对照组(CO组)斑马鱼进行检测,以斑马鱼基因(danio rerio assembly version GRCz10)作为参考基因组,对检测结果进行拼接与质量评估,筛选出差异表达基因,并进行GO和Pathway功能分析。荧光定量PCR对部分与肝脏有关的差异表达基因进行验证。结果表明,CO与CAPAP组的差异表达基因数量为72个,其中上调差异表达基因40个,下调差异表达基因32个。对CO与CAPAP组差异表达基因进行GO富集分析,上调基因主要富集于47个条目中,下调基因主要富集于16个条目中,这些基因涉及生物进程和分子功能等多种生物活性方面,说明对乙酰氨基酚对斑马鱼的发育有一定的影响。     

阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O_1大鼠肠黏膜屏障的影响

作者旨在研究阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O1大鼠肠黏膜机械屏障、免疫屏障和化学屏障的影响。选用60只6～8周龄SD大鼠进行试验,分为空白对照组、未治疗组、环丙沙星组和阿如拉-7味散高(1.08g·kg^-1)、中(0.54g·kg^-1)、低(0.27g·kg^-1)剂量组,共6组,每组10只。试验结束时,计算其保护率,并采集小肠各段进行HE染色,测定小肠黏膜形态指标;同时采集血清和回肠组织,ELISA试剂盒法检测血清中的D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)含量以及回肠黏膜中的分泌型免疫球蛋白(sIgA)和肠三叶因子(ITF)含量。结果表明:(1)阿如拉-7味散中剂量对感染致病性E.coli O_1大鼠的保护率最好,为50%;且对小肠黏膜形态有一定的改善和修复作用,其效果与环丙沙星相当;(2)环丙沙星组与空白对照组相比D-乳酸含量无显著差异(P>0.05);阿如拉-7味散高、中剂量组DAO含量与空白对照组相比无显著差异(P>0.05);(3)除阿如拉-7味散低剂量组外,其余各组与未治疗组相比回肠黏膜sIgA含量显著提高(P<0.05);未治疗组大鼠回肠黏膜ITF含量与其余各组相比显著降低(P<0.05)。结果提示,阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O_1大鼠引起的肠黏膜损伤有一定的修复作用,其中中剂量(0.54g·kg^-1)效果最佳,与抗生素环丙沙星的修复效果相当。     

乌丹蒿花粉形态二型性特征的观察

以内蒙古特有乡土沙生植物乌丹蒿（Artemisia wudanica）为研究对象,采用扫描电镜（Scanning Electron Microscopy,SEM）技术,对其花粉形态进行了详细的观察描述,探索其花粉形态的二型性特点,完善其花粉形态细微特征。结果表明：乌丹蒿花粉粒有长球形和圆球形之分,花粉形态存在明显的二型性特征。长球形花粉赤道面观为椭圆形,极面观为三裂片圆形;大小平均为：23.28 μm×13.73 μm;萌发器官为3孔沟类型;表面纹饰为刺状-颗粒状复合纹饰。圆球形花粉赤道面为圆球形;极面为三裂圆形;萌发器官也是3孔沟类型;大小平均为：14.85 μm×13.80 μm;表面纹饰亦为刺状-颗粒状复合纹饰。除花粉粒的大小、极轴与赤道轴的比值（Polar axis/Equatorial axis,P/E）不同外,两种类型的花粉总体形态特征基本一致;细微性状主要差异表现在表面纹饰中刺的大小及刺与颗粒的排列密度等方面。