猪链球菌9型钦州分离株cps9H基因序列分析

根据已发表的猪链球菌9型(SS9)荷兰5218分离株的基因核苷酸序列保守区域,设计一对特异性引物,以SS9钦州分离株抽提的DNA为模板,通过PCR方法扩增cps9H基因片段,并对其进行克隆、测序和分析。结果表明,4株SS9钦州分离株的cps9H目的基因长为389 bp,与已知的7个国内外SS9毒株cps9H基因片段的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为96.7%~100%和91.5%~100%。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

山羊关节炎-脑炎病毒甘肃株env基因的克隆和序列分析

本试验参考GenBank上发表的CAEV-63株的env基因核苷酸序列设计一对引物，以CAEV甘肃株前病毒DNA为模板，PCR扩增产物约2．9kb，与预期的目的片段大小一致。回收目的基因片段并将其克隆到pMD18-T载体上，经PCR及酶切鉴定阳性的重组质粒测序，结果表明所扩增2893个核苷酸片段含有CAEV囊膜基因的全序列，编码964个氨基酸。核苷酸和氨基酸序列分析显示，CAEV甘肃株env基因与CAEV-63美国株的env基固核苷酸和氨基酸的同源性分别为99．0％和98．1％。     

牛病毒性腹泻病毒P20和P14基因的克隆及序列分析

参考GenBank中BVDV Oregon C24V株的基因组序列设计两对引物,利用套式PCR方法扩增P20基因,扩增出预期525 bp的目的片段.扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序.测序结果与参考序列Oregon C24V比较,二者的核苷酸同源性仅为80.95%,推导氨基酸同源性为87.50%.测序结果经NCBI上的Blast(Http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)同源性比较,克隆得到的基因与Osloss株同源性最高,核苷酸同源性为93.65%,推导氨基酸同源性为95.83%.根据P20的测序结果,参照GenBank中BVDV Osloss株设计一对引物,扩增P14基因,经同源性比较,扩增的P14基因与Osloss株核苷酸同源性为94.77%,推导氨基酸同源性为95.10%,通过系统发生分析,推测P20基因和P14基因与Osloss株在进化上比较接近.     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析

根据NDV NP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物，利用RT-PCR扩增出了F48E9株NP基因1598bp的片段，将该片段克隆到pMD18-T Vector上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性，采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得了F48E9株NP基因片段的基因序列，利用DNASIS分析软件，将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较，其核苷酸序列同源性为88.2%。至此，我们获得了F48E9株NP基因的全长克隆。     

猪巨细胞病毒(PCMV)四川株gB基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的核苷酸序列(GenBank登录号:FJ870563.1)设计1对引物,采用PCR方法从确诊为猪巨细胞病毒的阳性样品中扩增gB基因,将其克隆到pMD19-T载体上,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒T-PCMV-gB,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上gB相应序列进行同源性分析。结果表明,该基因片段长度为2580 bp,与其他参考株gB基因的核苷酸同源性达98.0%～99.6%;其推导的氨基酸序列与人疱疹病毒6型和7型比较分析结果显示,其同源性分别为42.9%～43.6%和40.5%～40.6%。这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。     

新城疫病毒F_(48)E_9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆     

9型猪链球菌广东株的分离鉴定和基因序列分析

为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况，本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定，采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因，对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析，并构建系统发育树。结果显示，分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌，在鲜血琼脂平板中呈β溶血，可发酵大多数糖类，能成功扩增cps9D基因，含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2，表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%，说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高，且与国内外的流行毒株基本一致，未发生太大的变异。系统发育树表明，分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高，亲缘关系密切。     

番鸭细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考GenBank发表的MDPVFM株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出MDPVS1株NS2基因,目的片段长约1.3 kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明,MDPVS1株NS2基因全长1357 bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的MDPVFM株相比核苷酸序列同源性为99.26%,推导氨基酸序列同源性为98.23%。     

猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种与9型猪链球菌(SS9)的快速诊断方法,本研究根据GenBank已登录的SS种特异性基因gdh和SS9型特异性基因CPS9H设计引物,以标准SS9株基因组DNA为模板,建立了SS种和SS9的二重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对检测疑似猪链球菌感染猪临床样品,并与常规细菌分离鉴定方法进行了比对。结果表明成功建立SS种和SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100个CFU,特异性和重复性好;利用该方法对34份临床分离自疑似猪链球菌感染样品的细菌培养物进行了应用检测试验,其中有11份样品为gdh阳性,11份gdh阳性样品中有3份样品同时为SS9阳性。本研究成功建立了SS种与SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,可用于猪链球菌种和SS9型猪链球菌的快速诊断。     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

猪链球菌1、7、9型多重PCR诊断方法的建立及初步应用

为了建立猪链球菌（Streptococcus suis,SS）1、7、9型（SS1、SS7、SS9）的快速鉴别诊断和分型方法,本研究根据GenBank已登录的SS1型特异性的CPS1I基因、7型CPS7H基因、9型CPS9H基因设计引物,以标准SS1、SS7、SS9株基因组DNA为模板,建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的多重PCR检测方法对11份猪链球菌的临床分离纯化菌株进行了的应用检测。结果表明,成功建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100 CFU/mL,特异性和重复性好;利用多重PCR检测方法对11份猪链球菌临床分离纯化菌株检测结果表明,11份样品中有3份样品为SS9阳性、2份样品为SS7阳性、1份样品为SS1阳性。本研究为临床上SS1、SS7、SS9的快速鉴别诊断提供了一种新方法。     

江苏省某猪场猪链球菌分离鉴定及致病特性分析

为了探明2018年3月江苏省某规模化猪场发病猪的病原,本研究对发病猪进行采样和细菌分离,并对细菌进行了PCR鉴定、多位点序列分型(MLST)及小鼠致病力分析。结果发现:在该场4份发病猪组织中分离到猪链球菌2型(SS2)、猪链球菌9型(SS9)菌株各2株,MLST分析显示分离的SS2菌株属于ST7,SS9菌株属于ST243,SS2、SS9分离菌株的毒力基因表现型分别为mrp^+epf^+sly^+orf2^+sao^+fbps^+gdh^+和mrp^-epf^-sly^-orf2^+sao^-fbps^+gdh^+。动物试验显示其中3株猪链球菌分离菌株对BALB/c小鼠有较强致病力。研究结果为该养殖场猪链球菌感染防控措施的制定提供了重要参考。     

猪链球菌2型分泌核酸酶(SsnA)的表达、ELISA方法建立及其在鉴别诊断中的应用

猪链球菌2型(Streptococcussuis type 2,SS2)是一种广泛分布的人畜共患病原菌,严重危害着人类健康和养猪业的发展。本试验旨在研究分泌核酸酶基因(SsnA)作为分子诊断标识在对SS2感染的鉴别诊断中所起的作用。作者以SS2-LT菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增SsnA基因片段,将该片段克隆到表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为46 ku的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白质具有抗原反应活性。以纯化的融合蛋白作为包被抗原,建立了SsnA-ELISA鉴别诊断方法。对已知背景的人工感染及疫苗免疫血清和临床血清进行检测,比较感染血清和免疫血清的检测结果,结果发现两者差异显著(P<0.05),表明建立的SsnA-ELISA方法具有良好的检测效果。利用该方法对采集自8个省份的1 446份血清进行检测,显示SS2的阳性率为0%~14.77%,平均阳性率为5.39%。本研究结果表明:猪链球菌2型SsnA可以作为一个良好的鉴别感染的分子诊断标识;对临床血清的检测结果表明感染及流行与气候环境存在明显的关系。     

The Streptococcus suis Epidemiological Analysis of Healthy and Infected Swine in Guangdong Province

To investigate the epidemics of Streptococcus suis in Guangdong province, 228 samples from infected pigs,and 698 samples from healthy pigs including 243 samples from tonsils of slaughtered pigs and 455 nasal swabs of healthy pigs were analyzed.The results showed that the positive rate of Streptococcus suis of infected,healthy and slaughtered pigs were 82.02%(187/228),42.20%(192/455) and 32.10%(78/243),respectively.187 strains of Streptococcus suis were isolated from infected pigs and serotyped in 11 serotypes,including serotype SS1,SS2,SS3,SS4,SS7,SS8,SS9,SS16,SS19,SS29 and SS31, in which serotype SS2(16.58%),SS3(9.63%) and SS19 (7.49%) were dominant,flowed by SS7(6.95%)and SS9(5.34%),and 48.66% strains were non-typabled.Meanwhile,154 strains of Streptococcus suis from healthy swine(including farms and slaughter houses) were classified into 17 serotypes,including serotype SS2,SS3,SS4,SS5,SS7,SS8,SS9,SS10,SS12,SS15,SS16,SS17,SS19,SS21,SS23,SS29 and SS30,in which SS2(18.83%) and SS29(14.94%)were dominant,flowed by SS16(6.50%) and 31.82% strains were non-typabled.     

猪链球菌2型血清混浊因子基因的鉴定及其结构特征分析

猪链球菌是猪的主要病原,也可导致人感染,其致病机理尚未明确.作者设计了1对特异性引物,采用特异性PCR从2株猪链球菌血清2型606中国分离株和607日本分离株的基因组中,分离出2种血清混浊因子(of)基因,全长3 016 bp,编码938个氨基酸,其中日本分离株607的ofs基因序列与已知基因完全相同.中国分离株606的ofs基因与已知基因相差7个碱基,导致3个氨基酸替换,其中1个突变(Asp353Gly)位于蛋白的N端功能区,可能影响其血清混浊功能；另外2个氨基酸突变位于蛋白的C端重复区内.从2种OFS蛋白中,找出了细菌黏附因子共有的结构特征,2种OFS蛋白C端区含有保守的LPXTG结构,使OFS蛋白可固定于细菌的表面,但其中的3个重复序列与纤黏蛋白结合蛋白A等的相似性很低,两种OFS蛋白可能通过特殊的途径协助猪链球菌的黏附.猪链球菌ofs基因中重复序列和突变使得编码的蛋白表现出丰富的长度多态性.本研究获得的2种OFS属于中等长度的蛋白,均来自强毒力型猪链球菌.这些结果提示菌株606和607携带的ofs基因可能是猪链球菌的毒力基因,对猪链球菌的致病机理及其防治具有重要的意义.     

广东地区健康猪群和发病猪群猪链球菌流行病学调查分析

为了解广东地区猪群中猪链球菌（Streptococcus suis,SS）的流行情况,本研究对在广东地区养殖场采集的228份发病猪群样品及698份健康猪群样品（包括455份鼻拭子样品及243份屠宰场扁桃体样品）进行了SS携带情况的统计分析。结果显示,发病猪群SS的阳性率为82.02%（187/228）,健康猪群的SS阳性率为42.20%（192/455）,其中屠宰场屠宰猪群的SS阳性率为32.10%（78/243）。将从发病猪群分离到的187株SS及健康猪群（含养猪场和屠宰场）分离得到的154株SS进行血清型定型分析,结果显示,发病猪群共检测到11个血清型,包括SS1、SS2、SS3、SS4、SS7、SS8、SS9、SS16、SS19、SS29和SS31型,主要以SS2、SS3和SS19型为主,分别占16.58%、9.63%和7.49%;其次为SS7型（6.95%）和SS9型（5.34%）,未定型菌株占48.66%;健康猪群共检测到17个血清型,包括SS2、SS3、SS4、SS5、SS7、SS8、SS9、SS10、SS12、SS15、SS16、SS17、SS19、SS21、SS23、SS29和SS30型,主要以血清型SS2和SS29型为主,分别占18.83%和14.94%,其次为SS16型（6.50%）,未定型菌株占31.82%。     

猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。